Работа 8. Количественный учет микроорганизмов почвы методом предельных разведений на жидких питательных средах

Метод предельных разведений обычно используют при групповом анализе почвенных микроорганизмов для количественного определения аммонификаторов, нитрификаторов, денитрификаторов, клетчаткоразрушающих бактерий и др. Данный метод требует особо тщательного соблюдения правил стерильности как при приготовлении разведений почвенной суспензии, так и при посеве суспензии на питательные среды, так как каждая случайно занесенная клетка может привести сразу к значительной ошибке в численности микроорганизмов.

 Материалы и оборудование

Весы, разновесы, часовое стекло, скальпель, ступка, резиновая перчатка, колба со стерильной дистиллированной водой, пипетки на 10 мл и 1 мл, пробирки, две колбы объемом 250 мл, питательная среда.

Ход работы

Для количественного учета микроорганизмов методом предельных разведений на жидких питательных средах навеску исследуемой почвы подвергают растиранию в ступке, а затем готовят ряд последовательных разведений почвенной суспензии точно так же, как при посеве на твердые питательные среды (см. работу 23).

Приготовленную почвенную суспензию высевают в пробирки или колбы с питательной средой, соответствующей данной физиологической группе микроорганизмов. Так, для количественного учета аммонификаторов обычно пользуются пептонной водой, учета нитрификаторов—средой Виноградского, учета денитрификаторов—средой Гильтэя, учета клетчаткоразрушающих аэробов—средой Гетчинсона, учета клетчаткоразрушающих анаэробов—средой Имшенецкого, для учета маслянокислых бактерий—средой Виноградского. Состав и приготовление питательных сред приведены в работах при изучении микроорганизмов отдельных физиологических групп.

Для учета микроорганизмов, характеризующихся высокой численностью (аммонификаторы, денитрификаторы, маслянокислые бактерии), почвенную суспензию рекомендуется высевать из разведений 1/1000 и выше; для учета микроорганизмов, сравнительно мало распространенных (нитрификаторы, клетчаткоразрушающие бактерии), посев почвенной суспензии проводят из первых 2—4 разведений—1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000. В каждую пробирку или колбу с питательной средой стерильной пипеткой высевают по 1 мл почвенной суспензии из соответствующего разведения. Суспензией каждого разведения засевают 3—5 пробирок или колб.

Засеянные пробирки или колбы помещают в термостат для инкубации при температуре, оптимальной для данной физиологической группы микроорганизмов.

Количество микроорганизмов, развившихся на питательных средах, определяют по таблице Мак-Креди, составленной на основании методов вариационной статистики.

Для определения числа микроорганизмов в засеянных пробирках или колбах составляют так называемую числовую характеристику. Она состоит из трех цифр. Первая цифра соответствует числу пробирок последнего разведения, в котором еще обнаруживается рост микроорганизмов в пробирках всех повторностей. Следующие две цифры обозначают число пробирок с ростом микроорганизмов в двух последующих разведениях. Если рост микроорганизмов обнаружен более чем в двух последующих разведениях, число этих пробирок прибавляют к последней цифре.

По трехзначной числовой характеристике в таблице Мак-Креди находят вероятное число микроорганизмов в 1 мл разведения, принятого за первую цифру числовой характеристики. Умножив это вероятное число микроорганизмов на соответствующее разведение, получают количество клеток микроорганизмов в 1 г. исследуемой почвы. Для большей точности получаемых результатов содержание клеток микроорганизмов пересчитывают на 1 г. абсолютно сухой почвы, учитывая процент влажности почвы.

Пример 1

Разведение	1/10	1/100	1/1000	1/10000	1/100000
Число засеянных пробирок	3	3	3	3	3
Число пробирок, в которых обнаружен рост бактерий	3	3	2	2	0
Числовая характеристика — 321.

 

Вероятное число микроорганизмов по таблице Мак-Креди — 15,0.

Число микроорганизмов в 1 г. воздушно-сухой почвы: 15´100 = 1500.

 

Пример 2

Разведение	1/10	1/100	1/1000	1/10000	1/100000	1/1000000
Число засеянных пробирок	5	5	5	5	5
Число пробирок, в которых обнаружен рост бактерий	5	5	5	0	1	1
Числовая характеристика — 502

 

 

Вероятное число микроорганизмов по таблице Мак-Креди — 4,0.

Число микроорганизмов в 1 г. воздушно-сухой почвы: 4 ´ 1000 =4000.

Приводим таблицу Мак-Креди для быстрой обработки результатов учета микробов по методу предельных разведений

 

Числовая характеристика	Наиболее вероятное число микробов при заражении сред в параллельных пробирках							Числовая характеристика		Наиболее вероятное число микробов при заражении сред в параллельных пробирках
	2		3		4		б			2		3		4		5
000	0,0		0,0		0,0		0,0	141		--		--		1,7		--
001	0,5		0,3		0,2		0,2	200		2,5		0,9		0,6		0.5
002	--		--		0,5		0,4	201		5,0		1,4		0,9		0,7
003	--		--		0,7		--	202		--		2,0		1,2		0,9
010	0,5		0,3		0,2		0,2	203		--		--		1,6		1,2
011	0,9		0,6		0,5		0,4	210		6,0		1,5		0,9		0,7
012	--		--		0,7		0,6	211		13,0		2,0		1,3		0,9
013	--		--		0,9		--	212		20,0		3,0		1,6		1,2
020	0,9		0,6		0,5		0,4	213		--		--		2,0		--
021	--		--		0,7		0,6	220		25,0		2,0		1,3		0,9
022	--		--		0,9		--	221		70,0		3,0		1,6		1,2
030	--		--		0,7		0,6	222		110,0		3,5		2,0		1,4
031	--		--		0,9		--	223		--		4,0		--		--
040	--		--		0,9		--	230		--		3.0		1,7		1,2
041	--		--		1,2		--	231		--		3,5		2,0		1,4
100	0,6		0,4		0,3		0,2	232		--		0,4-		--		--
101	1,2		0,7		0,5		0,4	240		--		--		2,0		1,4
102	--		1,1		0,8		0,6	241		--		--		3,0		--
103	--		--		1,0		0,8	300		--		2,5		1,1		0,8
110	1,3		0,7		0,5		0,4	301		--		4,0		1.6		1,1
111	2,0		1,1		0,8		0,6	302		--		6,5		2,0		1,4
112	--		--		1,1		0,8	303		--		--		2,5		--
113	--		--		1,3		--	310		--		4,5		1,6		1,1
120	2,0		1,1		0,8		0,6	311		--		7,5		2,0		1,4
121	3,0		1,5		1,1		0,8	312		--		11,5		3,0		1,7
122	--		--		1,3		1,0	313		--		16,0		3,5		2,0
123	--		--,		1.6		--	320		--		9,5		2,0		1,4
130	--		1,6		1,1		0,8	321		--		15,0		3,0		1,7
131	--		--		1,4		1,0	322		--		20,0		3,5		2,0
132	--		--		1,6		--	323		.--		30,0		--		--
140	--		--		1,4		1,1	330		--		25,0		3,0		1,7
331	--		45,0		3.5		2,0	500		--		--		--		2,5
332	--		110,0		4,0		--	501		--		--		--		3,0
333	--		140,0		5,0		--	502		--		--		--		4,0
340	--		--		3,5		2,0	503		--		--		--		6,0
341	--		--		4,5		2,5	504		--		--		--		7,5
350	--		--		--		2,5	510		--		--		--		3,5
400	--		--		2,5		1,3	511		--		--		--		4,5
401	--		--		3,5		1,7	512		--		--		--.		6,0
402	--		--		5,0		2,0	513		--		--		--		8,5
403	--		--		7,0		2,5	520		--		--		--		5,0
410	--		--		3,5		1,7	521		--		--		--		7,0
411	--		--		5,5		2,0	522		--		--		--		9,5
412	--		--		8,0		2,5	523		--		--		--		12,0
413	--		--		11,0		--	524		--		--		--		15,0
414	--		--		14,0		--	525		--		--		--		17,5
420	--		--		6.0		2,0	530		--		--		--		8,0
421	—		—		9,5		2,5	531		—		—		—		11,0
422	--	--		13,0		3,0			532		--		--		--		14,0
423	—	—		17,0		—			533		---		—		—		17,5
424	—	—		20,0		—			534		—		—		—		20,0
430	—	—		11,5		2,5			535		—		—		—		25,0
431	—	—		16,5		3,0			540		—		—		—		13,0
432	—	—		20,0		4.0			541		—		—		—		17,0
433	—	—		30,0		—			542		—		—		---		25,0
434	—	—		35,0		—			543		—		—		---		30,0
440	—	—		25,0		3,5			544		—		—		---		35,0
441	—	—		40,0		4,0			545		—		—		—		45,0
442	—	—		70,0		—			550		—		—		---		25,0
443	—	—		140,0		—			551-		—		—		---		35,0
444	—	—		160,0		—			552		—		—		---		60,0
450	—	—		—		4,0			553		—		—		—		90,0
451	---	—		—		5,0			554		—		—		---		100,0
									555		---		---		---		180,0

Работа 9. Качественно – количественный учет микрофлоры почвы методом Д. М. Новогрудского

Микроорганизмы своей жизнедеятельностью в значительной мере влияют на почвообразовательные процессы, создавая условия для развития тех или иных биогеоценозов. Изучение микроорганизмов почвы является составной частью геоботанических исследований.

Для определения общего количества микроорганизмов в почве рекомендуется метод высева почвенного мелкозема на агаризованную воду по Д. М. Новогрудскому. Метод успешно используют для получения сравнительных данных о заселенности микроорганизмами различных почв с учетом почвенного горизонта, времени года, растения-эдификатора, ризосферной зоны, а также для выяснения соотношения отдельных групп микроорганизмов: бактерий, плесневых грибов и актиномицетов в почве.

Метод основан на высеве строго определенной навески почвенного мелкозема на агаризованную воду. Учетным элементом является почвенная частичка. Она естественный источник выделения микроорганизмов и одновременно природный субстрат. Ввиду крайней бедности среды рост микроорганизмов идет лишь в водной пленке вокруг почвенной частички, исключая плесневые грибы, способные образовывать свои водные пленки и разрастаться на поверхности агара.

Материалы и оборудование

Чашки Петри, пробирки с голодным агаром, сито с диаметром отверстий 0,25 мм, ступка, спиртовка, скальпель, весы аналитические, предметные стекла, лезвия бритвы, пробирка, микроскоп, исследуемая почва, резиновая перчатка.

Ходработы

Разогретую агаризованную воду, соблюдая стерильность, разливают в чашки Петри и дают пластинке застыть.

Небольшое количество воздушно-сухой исследуемой почвы тщательно растирают в ступке пальцем в резиновой перчатке и насыпают в сито с диаметром отверстий 0,25 мм. Сито с почвой взвешивают на аналитических весах и высевают почвенный мелкозем равномерно по всей поверхности агаровой пластинки. Следует учесть, что меньшая навеска почвы дает более высокие показатели. Наиболее благоприятна навеска до 20 мг. Сито с оставшейся почвой вновь взвешивают и определяют точную навеску высеянной почвы. Одной пробой почвы засевают три чашки Петри, две из них используют для подсчета бактерий и грибов, третью—для подсчета актиномицетов. Засеянные чашки Петри помещают в термостат на проращивание при температуре 25—28 °С.

Количество грибов и бактерий подсчитывают через 2—3 суток после посева, актиномицетов—через 5—7 суток.

Для учета количества микроорганизмов на агаровой пластинке пробиркой с ровным краем вырезают пять дисков: один—в центре пластинки и четыре—по двум взаимно перпендикулярным диаметрам. Диск переносят на предметное стекло и лезвием бритвы разрезают на полоски так, чтобы ширина полоски умещалась в поле зрения микроскопа при малом увеличении (объектив 8´, 10´, 20´, окуляр 10´, 15´).

Каждую полоску систематически просматривают под микроскопом и исследуют каждую почвенную частичку, отмечая, какие микроорганизмы развились в ее сфере. Одна почвенная частичка может дать начало одновременно колонии бактерий, актиномицетов и грибов. Группу слившихся почвенных частичек следует считать за один образовательный центр. Подсчитав количество микроорганизмов в пяти дисках, определяют содержание микроорганизмов в 1 г. исследуемой почвы по формуле:

Х = A x C / 5B x D

где х— количество микроорганизмов в 1 г. почвы, А — количество колоний в пяти дисках, В — площадь диска, см² (диаметр диска определяют полоской миллиметровой бумаги), с— площадь чашки Петри, 1 см² D — навеска почвы, г.

Для большей точности результатов следует внести поправку на влажность исследуемой почвы.

Наблюдения за бактериями

При высеве мелкозема вокруг почвенной частички образуется водная пленка, через 10—15 ч в ней развиваются первичные скопления бактериальных клеток. Нередко таких скоплений может быть два-три и более вокруг одной почвенной частички, что указывает на соответствующее число жизнеспособных зародышей. Через 24—48 ч клетки занимают все пространство водной пленки, формируя микроколонию. Микроколонии бактерий характеризуются крошечными размерами, одно-слойным расположением клеток, нередко меньшими размерами клеток. Далее в микроколонии могут происходить изменения: подвижные формы утрачивают подвижность, а спорообразующие формируют споры и т.д. Микроколонии могут быть сложными, образованными несколькими разными видами бактерий, располагающимися в виде островков, секторов, концентрических зон.

Наблюдения за грибами

Формы роста грибов вокруг почвенных частичек называют псевдоколониями. Последние отличаются от обычного роста на питательных средах редуцированными размерами (толщина гиф, длина конидиеносцев, размер и число конидиеспор) и упрощенной структурой (образованы из одной или немногих гиф, стерильных, реже с конидиальным плодоношением). В отличие от микроколоний бактерий гифы грибов формируют свои водные пленки, что и обеспечивает им рост по поверхности агара.