Превращение микроорганизмами азотсодержащих веществ

Работа 29. Аммонификация белка

Процесс разложения органических азотсодержащих веществ с выделением аммиака носит название аммонификации. Аммонификацию ведут различные микроорганизмы: бактерии, грибы, актиномицеты. Процесс идет в аэробных и анаэробных условиях.

Аммонификация белка начинается с гидролиза белка под влиянием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, с образованием последовательно пептонов, полипептидов, дипептидов и аминокислот.

Далее аминокислоты путем дезаминирования разрушаются с образованием аммиака и разнообразных органических соединений в соответствии с характером аминокислот и окружающих условий среды. Продукты промежуточного распада аминокислот могут быть ассимилированы клетками микроорганизмов или разрушены ими дальше. Основными конечными продуктами аэробной минерализации белка являются аммиак, углекислый газ, вода, соли серной и фосфорной кислот.

В анаэробных условиях промежуточные продукты распада аминокислот полностью не минерализуются. Поэтому при разрушении белка в анаэробных условиях, помимо аммиака и углекислого газа, накапливаются различные органические соединения: органические кислоты, спирты; сероводород и его производные—меркаптаны; токсические соединения—диамины и птомаины (в частности, кадаверин, компонент трупного яда); дурно пахнущие продукты — индол и скатол. Материалы и оборудование

Весы, разновесы, колба объемом 100—150 мл, стерильная дистиллированная вода, почва, водяная баня, электроплитка, спиртовка, микробиологическая петля, пинцет, скальпель, предметные стекла, целлофан, резиновые колечки, чашки Петри, красная лакмусовая бумага, полоски фильтровальной бумаги, пропитанные 10%-ным раствором ацетата свинца, водный раствор фуксина или генцианвиолета, микроскоп, пробирки с МПБ, МПА и средой Мишустина.

Ход работы

Получение накопительной культуры аммонификаторов-аэробов

Аммонификаторы-аэробы обычно выделяются на пластинках МПА в чашках Петри. Однако следует иметь в виду, что на МПА, помимо аммонифицирующих бактерий, могут выделяться и другие микроорганизмы.

Для заражения питательной среды в колбе объемом 250 мл готовят почвенную суспензию: 10 г почвы на 90 мл стерильной дистиллированной воды. Пробирки с МПА разогревают на водяной бане, охлаждают до температуры 40—50°С и заражают почвенной болтушкой, перенося одну петлю взвеси из колбы в пробирку с МПА. Содержимое пробирки перемешивают вращением ее между ладонями и выливают в стерильную чашку Петри. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 25— 28°С.

Через 3—4 суток на поверхности МПА в чашках Петри развиваются колонии микроорганизмов. Наиболее характерные из развившихся колоний описывают и микроскопируют. На пластинках МПА преимущественно развиваются колонии бацилл.

Вас. subtilis— подвижная палочка, одиночная или соединенная в длинные цепочки, размером 3—5 мкм. Споры овальные, располагаются центрально. Колонии на МПА, сухие, морщинистые, срастающиеся с агаром.

Вас. subtilis vа r те sеп tе riси s— подвижная палочка размером 3—10 мкм, часто соединенная в цепочки. Споры овальные, расположены центрально. Колонии на МПА тонкие, сухие, морщинистые, не срастаются с субстратом.

Вас. се rеи s— подвижная толстая палочка, нередко соединенная в цепочки, размером 3—5 мкм. Споры овальные, расположены центрально. Колонии на МПА, толстые, со складчатым центром и ризоидными волнистыми краями.

Вас. се rеи s vа r тусо idе s— подвижная палочка, одиночная или соединенная в цепочки, размером 5—10 мкм. Споры овальные, расположены центрально. Колонии на МПА, плоские ризоидные, стелющиеся по поверхности агара.

Помимо бацилл, на пластинках МПА развиваются колонии бактерий, преимущественно Р seudomonas fluorescens— мелкая, подвижная палочка размером 1—2 мкм. Культура образует зеленовато-желтый флуоресцирующий пигмент. На МПА колонии часто бесцветные, выпуклые, блестящие; Proteus vulgaris— клетки отличаются большой полиморфностью, в молодых культурах клетки мелкие, размером 1—3 мкм, подвижные, позднее появляются нитевидные формы длиной 10—20 мкм. Колонии стелются по поверхности агара тонким, едва заметным налетом, Achromobacter prodigiosum— мелкая, подвижная палочка, близкая по форме к кокку, размером 0,6—1,0 мкм. Колонии на МПА гладкие или зернистые, ярко-красные, с металлическим блеском.

Для выделения исключительно спорообразующих аммонифи-цирующих бактерий почвенную болтушку предварительно перед высевом пастеризуют на водяной бане 10 мин при температуре 80°С. При этом вегетативные клетки бактерий погибают, споры сохраняются жизнеспособными. Высев из почвенной болтушки проводят на среду Мишустина (смесь МПА с СА в отношении 1:1) в чашки Петри, как указано выше, для выделения аммонификаторов-аэробов.

На среде Мишустина по культуральным и частично по морфологическим признакам удается дифференцировать ряд бацилл на виды. При проведении микробиологического анализа почвы изучению споровых форм бактерий уделяется особое внимание, так как каждый тип почвы характеризуется своей специфичной бациллярной микрофлорой. Спорообразующим формам бактерий отводится ведущая роль в превращении сложных органических веществ в почве, не разлагающихся под воздействием неспороносных бактерий. Количество споровых форм бактерий в почве является, по Мишустину, показателем глубины трансформации органических веществ, а следовательно, и плодородия почвы.

Получение накопительной культуры аммонификаторов-анаэробов.

Аммонификаторы-анаэробы легко выделяются на мясном бульоне с добавлением 2%-ного пептона, оптимальная рН среды 7—8. Среду наливают высоким слоем в большие пробирки, закрывают плотно ватными пробками и стерилизуют в автоклаве.

 

Рис. 19. Аммонификаторы белка анаэробы: Clostridium paraputrificum и Clostridium bifermentas. Фуксин.

Рис. 19. Аммонификаторы белка анаэробы: Clostridium paraputrificum и Clostridium bifermentas. Фуксин.

 

Через 3—5 суток определяют продукты аммонификации белка. Выделение аммиака обнаруживается посинением красной лакмусовой бумаги, выделение сероводорода — почернением бумаги, смоченной уксуснокислым свинцом. Из нижних слоев жидкости готовят накопительный мазок, окрашивают его фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют.

Среду заражают комочком почвы. Для обнаружения выделяющегося аммиака под пробку пробирки подвешивают полоску красной лакмусовой бумаги, а для обнаружения сероводорода — полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10 %-ным раствором уксуснокислого свинца. Полоски бумаги не должны касаться жидкости в пробирке. Для герметичности пробирку плотно закрывают целлофановым колпачком, закрепляя его резиновым колечком. Зараженные пробирки помещают в термостат при температуре 25—28°С.

На препаратах преимущественно выделяются бактерии: Clostridium paraputrificum —подвижная, палочка, одиночная или соединенная в цепочки, размером 7 — 9 мкм. Спора расположено терминально на одном из концов клетки. Встречается в гниющих трупах, навозе, пищевых, продуктах; Clostridium bifermentas — подвижная палочка, одиночная или соединенная в цепочку, размером 3—5 мкм. Спора расположена эксцентрально. При разложении белка образуется большое количество сероводорода (рис. 19).