Сложные методы окрашивания. Питательные среды.

Выделение чистых культур аэробов

 

Цель занятия. Познакомиться со сложными методами окрашивания, образцами концентратов и готовых питательных сред, методами посевов материала на питательные среды. Разобрать структуру бактериальной клетки.

 

Оборудование и материалы. Рабочие места бактериологов, «смыв из раны», образца основных, элективных, дифференциально-диагностических питательных сред готовых и концентратов. Питательные среды для посева исследуемого материала в чашках Петри Электронный ресурс, таблицы «Питательные среды»

 

Задание для самостоятельной работы студентов. 1. Провести бактериоскопию исследуемого материала по Граму, результат зарисовать. 2. Освоить методику приготовления питательных сред из концентратов. 3. Познакомиться с ассортиментом питательных сред разного назначения. 4. Освоить методику посева исследуемого материала «штрихами» и выполнить работу первого дня по выделению чистых культур аэробов.  

 

 

Рис. 7

 

Сложные методы окрашивания бактерий

С помощью сложных методов окрашивания обнаруживают отдельные структуры бактерий, особенности их химического состава, что необходимо для определения их вида. 

К сложным методам окрашивания относят:

● Метод Грама, выявляет особенности химического состава бактерий.

● Метод Циля – Нильсена, для окрашивания кислото, спиртоустойчивых бактерий, таких как возбудители туберкулеза, паратуберкулеза, проказы.

● Метод Нейссера для выявления включений, используют для обнаружения возбудители дифтерии.

● Метод Гинса для обнаружения капсул.

● Метод Ауески или Ожешко для обнаружения спор.

● Метод Леффлера для обнаружения жгутиков у крупных бактерий.

● Метод Пешкова для окрашивания клеточной стенки.

● Метод Романовского – Гимза для окрашивания нуклеоида, применяют также для окрашивания клеток крови, хламидий, риккетсий.

Перечисленные классические методы окрашивания структур микрорганизмов являются ведущими. Известны и современные сложные методы окрашивания:

▪окраска акридиновым оранжевым для кислото- и спиртоустойчивых бактерий;

▪ окраска спор по Пешкову;

▪ выявление капсул по Рибегеру; ▪ окраска жгутиков по Грею, Петруку;

▪ окраска включений по Рискиной;

▪ выявление клеточной стенки по методу Кнази.

 

Сущность окраски по Граму

Бактерии, которые окрашиваются по Граму подразделяют на грамположительные (фиолетовые) и грамотрицательные (розовые).

Грамположительные бактерии имеют трехслойную клеточную стенку с большим количеством муреина, они прочно взаимодействуют с краской генцианвиолетом, рН цитоплазмы слабо кислый, хорошо адсорбирующий анионы иода, что укрепляет комплекс краски. Под действием спирта они не обесцвечиваются и сохраняют фиолетовое окрашивание.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий двухслойная, белковая, слабо воспринимающая окрашивание. рН цитоплазмы – нейтральный, анионы иода не адсорбируются и комплекс краски не укрепляется. Под воздействием спирта он разрушается, бактерии обесцвечиваются, необходимо докрашивание фуксином в розовый цвет.

 

Техника окраски по Граму

● На фиксированный мазок наносят краску генцианвиолет на 2 мин.

● Краску сливают, наносят раствор Люголя на 1 мин.

● Сливают раствор Люголя и наносят этиловый спирт на 30 сек.

● Отмывают мазок водой.

● Наносят фуксин Пфейфера на 2 мин.

● Отмывают мазок водой, высушивают, промокая фильтровальной бумагой.

 

Питательные среды

Питательные среды – это субстраты для выращивания бактерий. Они должны быть:

● Полноценными по питательному составу, содержать вещества в легкоусвояемой форме.

● Изотоничными, содержать не более 1-0,9% солей. ● Иметь оптимальный рН, чаще нейтральный 7,0 –

7,2.

● Иметь оптимальный окислительновосстановительный потенциал (eh).

● Должны быть стерильными и прозрачными.

Питательные среды готовят:

▪ из продуктов животного происхождения: мясо говядины, молоко, яйца, сыворотка крови;

▪ из продуктов растительного происхождения: картофель, морковь, кукурузный экстракт;

▪ синтетические, состоят из химически чистых соединений.