Определение эффективности консервантов лекарственных средств

Консерванты вводят в состав как стериль- ных, так и нестерильных лекарственных средств (табл. 32) для предотвращения роста микроорганиз- мов, попадающих в них во время технологическо- го процесса, или при неоднократном употреблении [28]. Они не должны использоваться, чтобы зама- скировать низкое качество производства. Учитывая возможность побочного действия, консерванты сле- дует применять только при строгой необходимости. Требования к консервантам:

• широкий спектр антимикробной активности;

• быстрота биоцидного действия;

• отсутствие взаимодействия с компонентами лекарственного средства;

• стабильность;

• отсутствие раздражающего или токсического действия биоцида или продуктов его распада.

Однако немногие вещества отвечают этим иде- альным требованиям. При использовании консерванта следует учитывать ряд факторов, влияющих на эффек- тивность его действия: микробная нагрузка, темпера- тура, рН, состав лекарственного средства.

В мультифазной системе консервант распределя- ется неравномерно в соответствии с его гидрофиль- ной или гидрофобной природой. Консервант может адсорбироваться на материале первичной упаковки, что снижает его активность. Концентрация летучих ве- ществ (хлороформа) может снижаться при повторном открывании контейнера.

Все лекарственные препараты, в состав которых входят консерванты, разделяются на категории, пред- ставленные в таблице 33.

Категории лекарственных препаратов, в состав которых входят консерванты

 

Категория                                                                                     Лекарственные препараты

ГФ XII, ч. 1, ОФС 42-0069-07        USP 33                                                 Eвропейская фармакопея 7.0

 

Таблица 33.

1 Инъекционные и другие парентеральные лекарственные препараты, включая эмульсии. Лекарственные препараты для введения

в полость уха, носа (стерильные), офтальмологические средства, водорастворимые или приготовленные на водной основе

2 Лекарственные препараты, применяемые местно, нестерильные лекарственные препараты для введения в полость носа, эмульсии, в том числе и на слизистые

3 Лекарственные препараты для приема внутрь, за исключением антацидов, водорастворимые или приготовленные на водной основе

 

4 Антацидные лекарственные препараты, приготовленные на водной основе

Парентеральные, офтальмологические, внутриматочные и интрамаммарные лекарственные препараты

 

Лекарственные препараты для введения в полость уха, носа, лекарственные препараты, используемые в виде кожных аппликаций и для ингаляций Лекарственные препараты для приема внутрь,

ректального введения, для нанесения на слизистую оболочку рта

-

 

Условия культивирования тест-микроорганизмов для приготовления инокулята

Таблица 34.

Тест-штамм                                           Питательная среда*                                                    Температура инкубации         Время инкубации

Escherichia coli АТСС 8739 или АТСС

25922

Pseudomonas аeruginosa АТСС 9027

Staphylococcus aureus АТСС 6538 Candida albicans

АТСС 10231

(или NCTC 885-653)

Соево-казеиновый агар или среда № 1

 

 

Соево-казеиновый бульон или среда № 8

 

Агар Сабуро с глюкозой или среда № 2, жидкая среда Сабуро или соево-казеиновый бульон

(32,5 ± 2,5)°C                   18-24 ч

 

 

(22,5 ± 2,5)°C                     48 ч

Aspergillus brasiliensis АТСС 16404 (или АТСС 9642)

Агар Сабуро с глюкозой или среда № 2                                    (22,5 ± 2,5)°C                  6-10 сут

 

* — допускается использование альтернативных жидких и агаризованных питательных сред отечественно- го и зарубежного производства.

 

Определение эффективности антимикробных консервантов в настоящее время выполняют в соот- ветствии с ОФС 42-0069-07 «Определение эффектив- ности антимикробных консервантов лекарственных средств» ГФ XII изд., ч. 1, с. 216-219.

Эффективность консервантов определяют в отно- шении определенных видов бактерий и грибов. В ка- честве тест-микроорганизмов используют виды бак- терий и грибов, которые являются наиболее частыми контаминантами ЛС:

Escherichia coli АТСС 8739 (или АТСС 25922), Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Staphylococcus aureus АТСС 6538,

Candida albicans АТСС 10231 (или NCTC 885- 653),

Aspergillus brasiliensis АТСС 16404 (или АТСС

9642).

Помимо перечисленных тест-штаммов можно использовать и другие микроорганизмы, которые должны быть типичными по культурально-морфо- логическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Набор тест-штаммов микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого ЛП. Все тест-штаммы микроорганизмов, получен-

ные из Государственных коллекций с сертификатом производителя в ампулах, на дисках или в другом виде следует восстанавливать способами, описан- ными в прилагаемых к тест-штаммам инструкциях или в соответствии с ГФ XII изд. ОФС «Микро- биологическая чистота». Условия культивирования тест-штаммов для приготовления инокулята пред- ставлены в таблице 34.

Контроль ростовых свойств используемых пита- тельных сред проводят в соответствии с ГФ XII изд. ОФС «Микробиологическая чистота».

При приготовлении инокулята суточные куль- туры тест-штаммов бактерий и C. albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Концентрацию клеток бактерий доводят до 109 КОЕ/мл, а C. albicans — до 107 КОЕ/мл, используя стандартный образец мут- ности или инструментальные методы, в том числе турбодиметрический.

Для смыва конидий A. brasiliensis используют сте- рильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твина-80. Количество конидий A. brasiliensis в 1 мл смыва определяют с помощью камеры Горяева или чашечным агаровым методом. Полученную взвесь разводят до концентрации 107 конидий в 1 мл.

Стандартизованные суспензии всех тест- штаммов микроорганизмов разводят до концентра- ции 107-108 КОЕ/мл, а для препаратов 4 категории —

105-106 КОЕ/мл.

Для определения эффективности консервантов ис- пользуют готовые ЛП в неповрежденной упаковке.

В 5 стерильных флаконов помещают достаточное количество испытуемого препарата. В каждый флакон вносят по 0,1 мл (но не менее 0,5% от объема иссле- дуемого препарата) одного из приготовленных иноку- лятов тест-штаммов (Е. coli, Р. aeruginosa, S. aureus,

C. albicans, A. brasiliensis) для получения концентра- ции 105-106 КОЕ в 1 мл или 1 г испытуемого образца и перемешивают.

Образцы лекарственных препаратов на твердой ма- зевой основе нагревают до температуры (47,5±2,5)°С. Смешивают инокулят каждой стандартизованной ми-

кробной суспензии с образцом препарата в течение

щее измерение не отличается от предыдущего более, чем на 50%. Антимикробные консерванты лекарствен- ных средств считают эффективными, если наблюдают уменьшение количества клеток бактерий в соответ- ствии с критериями, описанными в таблице 35.

В период с 7 до 14 сут. не должно наблюдаться увеличения числа бактерий. Количество клеток дрож- жеподобных и плесневых грибов не должно увеличи- ваться на протяжении всего срока исследования для всех категорий лекарственных средств.

 

Критерии оценки эффективности антимикробных консервантов лекарственных препаратов в отношении бактерий

Таблица 35.

Категория  Уменьшение количества клеток бактерий, log10

препарата               7 сут.              14 сут            28 сут    

1                               1                       3             Не должно

не менее 1 минуты до достижения гомогенной эмуль-

2                               -                       2

3                               -                       1

быть увеличения

сии.  Для  улучшения  смешивания  можно  добавить

определенное (валидированное) количество стериль- ного поверхностно-активного вещества, например, твина-80, если оно не влияет на жизнеспособность микроорганизмов или на эффективность консерванта.

Фактическую исходную концентрацию бактерий и грибов в контаминированных образцах определяют сразу после контаминации. Для этого чашечным ага- ровым методом делают посев на соответствующие пи- тательные среды (таблица 34), используя подходящие разведения для получения на чашке от 30 до 300 ко- лоний бактерий и от 10 до 100 колоний грибов. Для этой цели также можно применять метод мембранной фильтрации при условии растворимости ЛП в водных растворителях или изопропилмиристате.

Контаминированные образцы препаратов выдер- живают при температуре (22,5±2,5)°C в защищенном от света месте в течение определенного времени. Через 7, 14 и 28 сут. после инокуляции образцов препаратов

1 категории и через 14, 28 сут. препаратов 2 и 3 катего- рий определяют количество жизнеспособных микроор- ганизмов в 1 мл образца, делая высев на чашки Петри.

В случае необходимости в чашки с питательной средой или в соответствующее разведение лекарствен- ного средства перед посевом вводят инактиватор (ней- трализатор) антимикробного действия определенного вещества, указанный в ОФС «Микробиологическая чистота».

Учет результатов испытания проводят после посева чашечным агаровым методом, определяя ко- личество КОЕ/мл для каждого тест-штамма через ука- занные выше сроки инкубации контаминированного образца. Изменение количества микробных клеток по сравнению с исходной концентрацией в 1 мл вы- ражают в десятичных логарифмах (lg). При оценке эф- фективности антимикробного действия консервантов увеличение КОЕ/мл не фиксируется, если последую-

Уменьшение количества клеток грибов, log10 1, 2, 3    Не должно быть увеличения

4                 По сравнению с исходной концентрацией через

                    14 и 28 сут не должно быть увеличения                             

 

Испытание проводят с использованием следую- щих питательных сред:

• Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest agar)

Панкреатического гидролизата казеина                                     15,0 г

Папаинового гидролизата бобов сои                                          5,0 г

Натрия хлорида                                                                       5,0 г

Агара бактериологического                                                      15,0 г

Воды очищенной                                                                  1000 мл

рН после стерилизации                                                           7,3±0,2

 

Альтернативная отечественная среда для выра- щивания аэробных бактерий — Среда № 1 для контро- ля микробной загрязненности

• Соево-казеиновый бульон (Casein Soya Bean Digest Broth)

Панкреатического гидролизата казеина                                      17,0 г

Папаинового гидролизата бобов сои                                           3,0 г

Натрия хлорида                                                                        5,0 г

Калия фосфата двузамещенного                                                2,5 г

Глюкозы моногидрата                                                                2,5 г

Воды очищенной                                                                    1000 мл

рН после стерилизации                                                            7,3±0,2

 

Альтернативная отечественная среда для выра- щивания бактерий — Среда № 8 для контроля микроб- ной загрязненности

• Бульон Сабуро (Sabouraud- 2% Dextrose Broth)

 

Пептона (мясного)                                                                    5,0 г

Пептона (казеинового)                                                             5,0 г

Глюкозы моногидрата                                                             20,0 г

Воды очищенной                                                                  1000 мл

рН после стерилизации                                                           5,6±0,2

• Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar)

Альтернативная отечественная среда для выра- щивания дрожжевых и плесневых грибов — Среда № 2

Пептона

(мясного или казеинового)

Глюкозы моногидрата Агара

бактериологического

Воды очищенной

10,0 г

 

40,0 г

 

15,0 г

 

1000 мл

(агар Сабуро с глюкозой) для контроля микробной за- грязненности

Для предотвращения роста бактерий перед стери- лизацией добавляют 50 мг хлорамфеникола (левоми- цетина) на 1 л среды или перед использованием добав- ляют 0,1 г натриевой соли бензилпенициллина и 0,1 г тетрациклина на 1 л среды в виде стерильных раство-

рН после стерилизации                                                           5,6±0,2

ров.

Глава 18. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ

И АНТИСЕПТИКОВ