Методы испытания антимикробной активности антисептиков и дезинфектантов

в среду с антимикробным агентом, может быть изобра-                                                                         

жен графически (рис. 78).

Рис. 7 8. Динамика гибели микробных клеток в среде с дезинфектантом.

 

При этом возможна ситуация, когда процесс гибе- ли будет подчиняться законам кинетики первого по- рядка (А) и эффективность дезинфекции можно оце- нить, используя константу:

где К — константа скорости гибели клеток; N0 — начальное число живых клеток;

N — число живых клеток в момент времени t.

При испытании жидких форм определяют микро- боцидную концентрацию антисептика при заданной экспозиции, спектр антимикробного действия и эф- фективность антисептика в приближенных к практи- ке условиях [28]. Испытания проводят на стандарт- ных тест-культурах следующих видов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes и Mycobacterium terrae.

M. terrae культивируют на среде Левенштейна — Иенсена, другие бактерии и грибы — на средах, реко- мендованных для определения чувствительности к ан- тибиотикам и исследования микробной контаминации лекарственных препаратов.

Плотность микробной взвеси должна составлять 108-1011 КОЕ/мл (КОЕ — колониеобразующая едини- ца). Взвесь готовят на 0,5%-ном растворе натрия хло- рида с нейтральным pH. Для опытов с белковой на- грузкой в суспензию добавляют 20% сыворотки крови или 0,2% альбумина.

Экспозицию устанавливают от 30 с до 5 мин. Для установления действующей в этот срок концентрации готовят растворы с содержанием антисептика 100, 75, 50, 25, 12%.

Параллельно проводят контрольный эксперимент по определению чувствительности тест-культуры к фенолу в концентрации 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,06%. В раствор антисептика вносят взвесь тест-культуры (на 1 мл раствора 0,1 мл взвеси.) По истечении экс- позиции антисептик нейтрализуют и смесь высевают

на стандартную для данного штамма среду. В качестве нейтрализатора используют вещество, инактивирую- щее определенный класс соединений или все классы антисептических препаратов. К последнему типу от- носится смесь, содержащая 3% твина-80 и по 0,1% са- понина, цистеина и гистидина.

При допуске новых препаратов в медицинскую практику ставят:

а) качественный суспензионный тест; б) количественный суспензионный тест;

в) тест, приближенный к практике использования антисептика.

Качественный суспензионный тест ставят по опи- санному выше методу. Тест-культуры: St. aureus, Е. coli, Р. mirabilis, Р. aeruginosa, С. albicans. Плотность микробной суспензии должна соответствовать 108-109 КОЕ/мл. Срок инкубации культур после высева: для бактерий 48 час. при 37°C, для С. albicans — 72 час. при 20-25°C.

Для гигиенической антисептики препарат счи- тается пригодным, если он угнетает рост всех тест- штаммов при экспозиции 0,5-1 мин в допустимой по переносимости концентрации. Препарат, предна- значенный для хирургической антисептики рук, дол- жен угнетать рост всех тест-культур при экспозиции 3-5 мин.

Количественный суспензионный тест.

Тест-культуры — St. aureus, Е. coli; плотность взвеси 1-1,5´10”’ КОЕ/мл. Для каждой культуры го- товят два ряда разведений антисептика: без белковой защиты и с добавлением 0,2% альбумина. Экспозиция препарата и культуры 0,5, 1 и 5 мин. Далее смесь ней- трализуют и высевают на питательный агар.

Активность препарата оценивают по степени сни- жения величины КОЕ/мл по сравнению с контролем (микробная взвесь без антисептика). Препараты для гигиенической антисептики должны снижать КОЕ/мл в рекомендуемой для применения концентрации при экспозиции 0,5-1 мин. не менее, чем в 105 раз, препа- раты для хирургической антисептики должны обеспе- чить такую же степень снижения КОЕ/мл за 3-5 мин.

Тест с условиями, приближенными к практиче- скому применению, ставят на людях-добровольцах. На кожу кисти рук наносят взвесь Е. coli (1 x1011 КОЕ/ мл), подсушивают 3 мин. на воздухе и протирают руки испытуемым раствором антисептика: для гигиени- ческой антисептики 1 мин., используя 3 мл препара- та, для хирургической — 5 мин. 2-3 раза, используя по 5 мл препарата. Далее делают смыв с рук жидкой питательной средой. В контроле

а) делают смыв с контаминированных рук без об- работки антисептиком,

б) руки обрабатывают 3 мл стандартного антисеп- тика (изопропанола) дважды по 30 с, после чего дела- ют смыв.

Разведения смывов (10–1, 10–2, 10–3) засевают на питательный агар и инкубируют при 37°C 48 час. Оценку эффективности испытуемого препарата про- водят путем сравнения степени снижения количества тест-микроорганизма после обработки рук испытуе- мым и стандартным антисептиками.

Определение антимикробной активности анти- септиков в мягких и твердых формах проводят на плот- ной питательной среде, засеянной тест-культурой. Об- разцы размещают на поверхности среды или в лунках, подобно тому, как это делают при испытании антибио- тиков чашечным методом. Об активности препарата судят по диаметру зоны задержки роста вокруг образ- ца в сравнении со стандартным препаратом.

Испытуемый препарат можно растворить или эмульгировать в жидкой среде (например, в буферном растворе с соответствующим эмульгатором) и опреде- лить его активность методами, описанными выше для жидких форм.