Выделение и характеристика казеина

 

* Выделение казеина из молока

1. 30 мл снятого молока разбавляют четырьмя объемами воды.

2. К полученному препарату при помешивании добавляют по каплям 0.1% раствор уксусной кислоты до прекращения выпадения осадка казеина (избегать избытка кислоты, так как казеин в сильнокислой среде растворяется!).

3. Осадок казеина отфильтровывают и промывают водой.

4. Для отделения жиров и других соединений казеин растворяют в 0.1% растворе карбоната натрия. При этом казеин переходит в раствор, а жиры остаются во взвешенном состоянии.

5. Смесь фильтруют используя влажный фильтр, при этом жиры остаются на фильтре.

6. К фильтрату, представляющему собой раствор натриевой соли казеина снова добавляют 0.1% раствор уксусной кислоты.

7. Полученный осадок казеина отфильтровывают, отжимают между листами фильтровальной бумаги, по возможности, досуха.

8. Подсушенный казеин обезвоживают посредством растирания в ступке с 20 мл спирта.

9. Затем для полного удаления жиров казеин встряхивают в большой пробирке сначала с эфиром, а затем с 20 мл смеси метилового спирта и хлороформа (1:1).

10. Очищеный казеин высушивают на воздухе до получения белого порошка.

 

* Определение остатков фосфорной кислоты в казеине

Приготовление образца:

1. Навеску казеина (0.05 г) смешивают в тугоплавкой пробирке с 0.3 мл (5 каплями) концентрированной серной кислоты и таким же количеством азотной кислоты.

2. Пробирку нагревают в песочной бане. Смесь обугливается и при дальнейшем нагревании приобретает бурую окраску.

3. Через 10 мин, если раствор не обесцвечиватся, добавляют еще 2 капли азотной кислоты и продолжают нагревание. Эту процедуру повторяют до полного обесцвечивания смеси.

4. Затем добавляют 2 мл воды и продолжают нагревание для удаления оставшейся азотной кислоты

5. После этого смесь нейтрализуют используя для контроля индикаторную бумагу. Нейтрализацию осуществляют добавлением по каплям 5 М раствора гидроксида натрия (при добавлении избытка щелочи, ее нейтрализуют 1-2 каплями 10 М раствора серной кислоты).

 

Реакция открытия фосфорной кислоты молибдатом аммония:

6. К 2 мл молибденового реактива (раствора молибдата аммония в азотной кислоте) прибавляют 1 мл анализируемого раствора.

7. Смесь нагревают до кипения и кипятят 2-3 мин.

8. Записывают наблюдаемые изменения и объясняют результаты.

 

Тема II. Методы количественного определения белка

* Количественное определение белка биуретовым методом

1. В соответствии с табл. 1 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 10 мг бычьего сывороточного альбумина в 1мл.

2. В каждую пробирку, содержащую 0,2-1 мг белка в 1мл, а так же к 1 мл исследуемого образца добавить по 4 мл биуретового реактива.

3. Смеси инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.

4. Регистрируют оптическую плотность проб на спектрофотометре при l 540 (560) нм. В качестве контроля используют раствор, состоящий из 1мл воды и 4 мл биуретового реактива.

5. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

6. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

 

* Количественное определение белка по методу Лоури

1. Смешивают 50 мл раствора А и 1 мл раствора Б.

2. В соответствии с табл. 2 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 500 мкг бычьего сывороточного альбумина в 1мл. В каждую пробирку, содержащую 25-500 мкг белка в 1 мл, а так же к 1 мл исследуемого образца приливают по 5 мл смеси растворов А и Б.

3. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают и инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре.

4. При постоянном перемешивании в пробирки быстро вносят по 0,5 мл реактива Фолина.

5. Пробирки инкубируют в течение 30 минут.

6. Регистрируют оптическую плотность при l=750 нм против контрольной пробы.

7. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

8. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

 

* Количественное определение белка по методу Брэдфорд

1. В соответствии с табл. 3 готовят ряд разведений исходного раствора белка, содержащего 100 мкг бычьего сывороточного альбумина в 0,1мл. В каждую пробирку, содержащую 10-100 мкг белка в 0,1 мл и к 0,1 мл исследуемого образца приливают по 5 мл реактива Брэдфорд.

2. Пробы инкубируют в течение 5 минут.

3. Регистрируют оптическую плотность при l=595 нм против контроля.

4. Строят калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

5. Концентрацию белка в исследуемом образце определяют по калибровочному графику.

 

Оформление работы

К занятию:

1. Изучить и кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать основные этапы работы.

3. Описать полученные результаты по теме I и сделать выводы.

4. Результаты измерений оптической плотности занести в таблицы (см. ниже).

5. Построить калибровочные графики.

6. Расчитать концентрации белка в исследуемых образцах.

7. Описать полученные результаты по теме II и сделать выводы.