Общая характеристика процесса транскрипции у эукариотических организмов

У эукариот имеется 3 типа РНК-полимераз (не считая митохондриальной и хлоропластной):
РНК полимеразаI- синтезирует в ядрышках рибосомные RNA (18S и 28S рРНК, кроме 5S);
РНК-полимеразаII - синтезирует mRNA и некоторых sRNA;
РНК-полимеразаIII - синтезирует tRNA, sRNA, 5S rRNA.
RNA-полимеразы эукариот отличаются: количеством субъединиц – 2 большие (120-220кДа) и до 8 малых (10-100кДа), потребностью в ионах Mg и Mn, чувствительностью к – амонитину - токсину бледной поганки - пептиду включающему D-аминокислоты: polI - устойчива, polII - ингибируется при концентрации 10-8М, polIII - при 10-6М амонитина. РНК-полимеразы I,II,III кодируются в ядре. Большие субъединицы гомологичны β и β`-субъединицам эубактерий

PolII Человека содержит более 10 субъединиц, слабо ассоциирующих друг с другом. Некоторые из них принадлежат к основным факторам транскрипции (GTF). Белки holo-фермента PolII дрожжей.
Pol II - РНК-Полимеразная активность, взаимодействует с множеством общих и тканеспецифических факторов транскрипции, участвует в выборе точки инициации транскрипции.
TFIIB - Связывает Pol II и TBP на промоторе, участвует в выборе точки инициации транскрипции
TFIIF - Взаимодействует с Pol II, стимулирует элонгацию транскрипции Pol II, компонент субкомплекса SRB/медиатор
TFIIH - Активность ДНК-зависимой ATPазы, ДНК-геликазная активность, обладает активностью CTD-киназы
SRB2, SRB5 - Участвуют в образовании инициационного комплекса, стимулируют базальный и индуцированный синтез РНК,
взаимодействуют с TBP, компоненты субкомплекса SRB/медиатор
GAL11/SPT13 - Участвуют в образовании инициационного комплекса, стимулируют базальный и индуцированный синтез РНК,
компоненты субкомплекса SRB/медиатор, предположительно взаимодействуют с активаторами транскрипции
SUG1 - Компонент субкомплекса SRB/медиатор, предположительно взаимодействует с активаторами транскрипции
SRB4, SRB6, SRB7, SRB8, SRB9, SRB10, SRB11 - Компоненты субкомплекса SRB/медиатор, предположительно
взаимодействуют с CTD-доменом Pol II

 

44. Открытие процесса транскрипции

Э.Волкин и Л.Астрахан в 1956 г. обнаружили, что при заражении бактериальных клеток бактериофагом Т2, последние начинают синтезировать новые типы РНК, сходные по нуклеотидному составу с ДНК бактериофага. Сидней Бреннер, Франсуа Жакоб и Мэтью Мезельсон в 1961 г. поставили эксперимент, показывающий, что после инфицирования бактерий E.coli бактериофагом Т2 происходит синтез большого количества нового типа РНК, которая была названа матричной или информационной. РНК-полимераза у бактерий была открыта независимо Сэмом Вайссом и Джерардом Хурвицем в 1960.

 

Составляющие элементы процесса транскрипции

РНК-полимераза+НТФ +ДНК-матрица =РНК + ДНК-матрица + ФФн.

РНК-полимераза E.coli – это белок который имеет четвертичную структуру. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул данного РНК-полимеразы.

Субъединичный состав РНК-полимеразы E.coli:

2 αββ^’δω – holo-фермент (полный)

2 αββ^’ω – core-фермент (150х115х110А)

Без δ-фактора это core-фермент. δ-фактор это сменный фактор специфичности (δ70, δ28, δ54 ).

Две α субъединицы это каркас РНК-пол. К ним крепятся остальные субъединицы.

β^’- субъединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счет кластера положительно заряженных аминокислот.

β – в субъединице находится 2 каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой за элонгацию РНК- цепи. Один центр при этом работает в holo-ферменте, а другой в core- ферменте.

ω: восстанавливает РНК-полимеразу обратно в дееспособную форму. Также обнаружено ее защитное/шаперонное действие на β'-субъединицу у микобактерий.

σ-субъединица играет центральную роль в инициации транскрипции,

будучи прямо вовлеченной в узнавание промотора и плавление ДНК.

В клетках E. coli имеется семь различных σ-факторов, каждый из

которых обеспечивает узнавание промоторов c определенными

последовательностями (т.е. определенные гены). В экспоненциальной фазе роста более 90% молекул холоферментa в клетке содержит субъединицу σ70.

σ-фактор нарушает способность фермента связываться со случайным

участком ДНК примерно в 10 000 раз, и образующиеся комплексы ДНК-фермент становятся очень короткоживущими

 

 

Механизм транскрипции

Механизм транскрипции 4 этапа:

1. Узнавание промотора, 2. Инициация, 3. Элонгация, 4. Терминация

Инициация транскрипции—сложный процесс, зависящий от последовательности ДНК вблизи транскрибируемой последоват-ти (а у эукариот также и от более далеких участков генома — энхансеров и сайленсеров) и от наличия или отсутствия различных белковых факторов.

Элонгация.Три основных биохимич.события характеризуют переход к элонгации в случае РНК-полимеразы кишечной палочки: отделение сигма-фактора, первая транслокация молекулы фермента вдоль матрицы и сильная стабилизация транскрипционного комплекса, который кроме РНК-полимеразы включает растущую цепь РНК и транскрибируемую ДНК. Эти же явления характерны и для РНК-полимераз эукариот. Переход от инициации к элонгации сопровожд-ся разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции, а в ряде случаев—переходом РНК-полимеразы в состояние компетентности в отношении элонгации (например, фосфорилирование CTD-домена у РНК-полимеразы II). Фаза элонгации заканч-ся после освобождения растущего транскрипта и диссоциации фермента от матрицы (терминация).

На стадии элонгации в ДНК расплетено прим.18 пар нуклеотидов. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибридную спираль с растущим концом цепи РНК. По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади — восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением РНК-полимеразы и ДНК. Трудно себе представить, как это может происходить в клетке, особенно при транскрипции хроматина. Поэтому не исключено, что для предотвращения такого вращения двигающуюся по ДНК РНК-полимеразу сопровождают топоизомеразы.

Элонгация осуществляется с пом.основных элонгирующих факторов, необходимых, чтобы процесс не останавливался преждевременно.

В последнее время появились данные, показывающие, что регуляторные факторы также могут регулировать элонгацию. РНК-полимераза в процессе элонгации делает паузы на определенных участках гена. Особенно четко это видно при низких концентрациях субстратов. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, т. н. паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. Продолжительность этих пауз может контролироваться факторами элонгации.

Терминация. У бактерий есть 2 мех-ма терминации транскрипции:

---ро-зависимый механизм, при котором белок Rho (ро) дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и мРНК, высвобождая молекулу РНК.

---ро-независимый, при котором транскрипция останавливается, когда только что синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов (…УУУУ), что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.

---Терминация транскрипции у эукариот менее изучена. Она завершается разрезанием РНК, после чего к её 3' концу фермент добавляет несколько аденинов (…АААА), от числа которых зависит стабильность данного транскрипта.

47. Факторы, влияющие на процесс транскрипции
Факторами транскрипции(другое название - специфические последовательности ДНК связующие факторы) в молекулярной биологии называют белки, связывающиеся с регуляторными участками ДНК с помощью своих ДНК-связывающих доменов и является частью системы, регулирует транскрипцию, то есть передачу генетической информации от ДНК к РНК ^{[1] [2]} .

Различные факторы транскрипции могут как способствовать связыванию РНК-полимеразы с промотором (в таком случае наблюдается активация транскрипции, а сам фактор называется «активатором»), так и предотвращать связывание РНК-полимеразы (в таком случае происходит репрессия транскрипции, а сам фактор называется «репрессором»). Факторы транскрипции выполняют такую ​​функцию либо самостоятельно, либо используя другие вспомогательные белки. В зависимости от функции, эти белки также делятся на «коактиваторы» и «корепресоры».