Значение исследований генетических процессов для различных отраслей человеческой деятельности

Значение исследований генетических процессов для различных отраслей человеческой деятельности

У спех достигнут в секвенировании генома в патоген организмов и переносчиков заболеваний.Это представляет интерес для профилактики лечения, диогностики заболеваний. Уже секвенировано около 30 геномов микроорганизмов. Изучены практически все геномы вирусов и почти все белок-кодирующие районы геномов прокариот. Расшифровка вирусных геномов, значение механизмов инфецирования, репликации, формирование новых вирусных частиц позволяет проектировать антивирусные лекарства, разрушающие вирусный геном. Широкое использование ПЦР для идентификации орагизмов. Например ПЦР позволяет отслеживать и оценивать активность инфекционного процесса до и по ходу олечения вирусного гепатита С.

 

Выделение ДНК и РНК

Этапы выделения ДНК и РНК

1.Разрушение клеток.

2.Отделение нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и др. соединений.

3.Осаждение нуклеиновых кислот.

4.Анализ чистоты препарата.

В зависимости от организма выделяют ДНК используя различные методы разрушения клеток:

1.Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий – лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия.

2.Разрушение клеток животных и человека: пользуют протеиназами.

3.Для разрушения клеточных стенок растений – ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. используют обработку хелатирующими агентами, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания двухвалентных катионов.

2. Отделение нуклеиновых кислот от белков осуществляют:

- осуществляют с помощью фенола и хлороформа (белки переходят в фазу растворителя). смесь водонасыщенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование.

белки разрушают протеиназами, например, протеиназой К;

-центрифугированием для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл.

Ряд современных методов предусматривает(осаждение ДНК на гранулах силикагеля добавл гуанидинтиоцианат).

3.Оставшиеся НК в водном растворе осаждают раствор этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном р-ре.

4. Для оценки чистоты препарата ДНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК д.б. больше 1,8. Значение А260/235 должно быть больше, чем 2,2.

 

 

4. Геномная революция 1990-х гг. Вклад К. Вентера в развитие геномных исследований

В 1953 году Крик и Уотсон открыли двойную спираль ДНК, что дало толчок к полувековому развитию молекулярной биологии, завершившуюся осуществлением проекта «Геном человека».

Крейг Вентер был президентом компании Celera Genomics, занимавшейся параллельной коммерческой версией проекта «Геном человека». В этой компании в 1999 году использовался метод дробовика(используемый для секвенирования длинных участков ДНК. Суть метода состоит в получении случайной выборки клонированных фрагментов ДНК данного организма, на основе которых может быть составлена его геномная библиотека.). Целью проекта было создание генетических баз данных и их коммерческое использование. Вентер был вынужден раскрыть генетические данные и включить их в проект «Геном Человека». Несмотря на различие мотиваций и конкуренцию Ветер и Коллинз вместе обьявили, в июне 2000 года о «первой сборке генома человека». это была первая реконструкция полного генома человека, выполненная методом беспорядочной стрельбы. В феврале 2001 был опубликован первый предварительный набросок генома человека. (Изучение генома началось в 80-х годах. В последствии была создана Международная организация по изучению генома человека HUGO (Human Genome Organization)). Изучением генома занимабтся ученые США, Японии, ряда стран Европы, России и др.)

Цели проекта:

1.Идентефикация 20тыс-25тыс генов ДНК

2.Определение последовательности 3 млрд.пар химических оснований, составляющих ДНК человека, и сохранение этой информации в базе данных

3.Усрвершенствование приборов для анализа данных

4.Внедрение новейших технологий в область частного использования

5.Исследование этических, правовых и социальных вопросов, возникающих при расшифровке генома.

Проект состоит из 5 основных этапов:

1.Составление карты, на которой помечены гены, отстоящие друг от друга не более,чем на 2млн оснований с разрешением 2МБ(Мегабаза)

2.Завершение физич.карт каждой хромосомы с разрешением 0,1 Мб.

3.Получение карты всего генома в виде набора описанных по отдельности клонов.

4.К 2004г. полное секвенирование ДНК

5.Нанесение на карту с разрешением в 1 основание всех генов человека.

В ходе проекта создают три типа карт хромосом: генетические, физические и секвенсовые.

 

Горизонтальный перенос генов и пластичность прокариотических геномов

Изучение бактерий привело к открытию горизонтального переноса генов, который был описан в Японии в 1959 г.

Горизонтальный перенос генов - любой процесс, при котором организм или клетка передает ген.материал другому организму (клетке), не являющийся его потомком.

У прокариот м.происходить частичное объединение геномов. При конъюгации клетка-донор в ходе контакта передаёт клетке-реципиенту часть своего генома (в некот.случаях весь). Участки ДНК донора м.обмениваться на гомологичные участки ДНК реципиента. Вероятность такого обмена значима только для бакт.одного вида.

Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, компетентностью (клеточной стенки и плазмалеммы: становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются– факторы компетентности). бактериальная клетка может поглощать и свободно находящуюся в среде ДНК, включая её в свой геном в случае высокой степени гомологии с собственной ДНК - трансформация. В природных условиях протекает обмен генетической информацией при помощи умеренных фагов (трансдукция). При трансдукции в вирионы попадает ДНК клетки-хозяина. Вирионы заражают другие клетки, и ДНК исходной бактериальной клетки проникает в другую бактериальную клетку. Вирусная ДНК интегрируется в бактериальную хромосому, а привнесенная бактериальная ДНК рекомбинирует с ДНК бакт. хромосомы. В рез.50% клеток оказываются трансформированными.

Кроме этого, возможен перенос нехромосомных генов при помощи плазмид определённого типа, кодирующих этот процесс, процесс обмена другими плазмидами и передачи транспозон.

При горизонтальном переносе новых генов не образуется (как то имеет место при мутациях), осуществляется создание разных генных сочетаний. Это важно так как естественный отбор действует на всю совокупность признаков организма.

Горизонтальный перенос генов - перенос генетич.информации от одного генома к другому, в особенности между двумя видами.

Для переноса необходимы факторы:

1. посредник для транспортировки генетической информации между организмами и клетками.

2.Молек-ный механизм для встраивания чужеродных кусков ДНК в хозяйский геном. Ретровирусы способны выполнять обе эти ф-ции.

Горизонтальный перенос можно обнаружить при значительном нарушении «непрерывности» филогенетического распределения определенного гена.

Горизонтально могут переносится два типа последовательностей:

1. последовательности их транспозиционных элементов

2.Геномные последовательности

Существует очень мало случаев, когда горизонтальный перенос геномных последовательностей был убедительно доказан. Многие подобные заявления впоследствии не были подтверждены на молекулярном уровне.

 

Методы гибридизации ДНК

Гибридизация ДНК, гибридизация НК — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных НК в одну молекулу. При полнойкомплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК. Эксперименты:

1.Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.

2. Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.

3. Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК гибридизуются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями)-образуется «гибридная» мол.ДНК.

Анализ скорости отжига (= гибридизации) одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.

 

Разновидности ПЦР

--- Вложенная ПЦР (Nested PCR)—применяется для уменьшения числа побочных продуктов р-ции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

--- Инвертированная ПЦР (Inverse PCR)—используется, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последоват-ти. Этот метод полезен,когда нужно определить соседние последоват-ти после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

---ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

---Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR)—проводится, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Модификаций этого метода является Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), в котором используются праймеры с разной концентрацией, и праймер с низкой конц-цией подбирается с высокой (темп.плавления), чем праймер с высокой конц-цией. ПЦР проводят при высокой темп.отжига-удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов.

---Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) или ПЦР в реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (но лучше использовать SYTO 13), который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный)[17].

---Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.

---Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

---ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR).

---ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, бычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq-полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq-полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к Pfu-полимеразе.

---RAPD (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворит.отличия картины ПЦР для двух организмов.

---Групп-специфическая ПЦР (group-specific PCR) — ПЦР для родственных последоват-тях внутри одного или между разными видами, используя консервативные праймеры к этим последоват-тям. Например, подбор универсальных праймеров к рибосомальным 18S и 26S генам для амплификации видоспецифического межгенного спейсера: последовательность генов 18S и 26S консервативна между видами, поэтому ПЦР между этими генами будет проходить для всех исследуемых видов. Противоположный этому методу является — уникальная ПЦР (англ. unique PCR), в котором задача состоит в подборе праймеров для амплификации только конкретной последовательности среди родственных последовательностей.

---ПЦР с использованием горячего старта (Hot-start PCR) — модификация ПЦР с использованием ДНК-полимеразы, в которой полимеразная активность блокируется при комнатной температуре антителами или имитирующие АТ небольшими молекулами типа Affibody, т.е.в момент постановки реакции до первой денатурации в ПЦР. Обычно первая денатурация проводится при 95 10 минут.

 

 

 

Механизм транскрипции

Механизм транскрипции 4 этапа:

1. Узнавание промотора, 2. Инициация, 3. Элонгация, 4. Терминация

Инициация транскрипции —сложный процесс, зависящий от последовательности ДНК вблизи транскрибируемой последоват-ти (а у эукариот также и от более далеких участков генома — энхансеров и сайленсеров) и от наличия или отсутствия различных белковых факторов.

Элонгация. Три основных биохимич.события характеризуют переход к элонгации в случае РНК-полимеразы кишечной палочки: отделение сигма-фактора, первая транслокация молекулы фермента вдоль матрицы и сильная стабилизация транскрипционного комплекса, который кроме РНК-полимеразы включает растущую цепь РНК и транскрибируемую ДНК. Эти же явления характерны и для РНК-полимераз эукариот. Переход от инициации к элонгации сопровожд-ся разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции, а в ряде случаев—переходом РНК-полимеразы в состояние компетентности в отношении элонгации (например, фосфорилирование CTD-домена у РНК-полимеразы II). Фаза элонгации заканч-ся после освобождения растущего транскрипта и диссоциации фермента от матрицы (терминация).

На стадии элонгации в ДНК расплетено прим.18 пар нуклеотидов. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК образует гибридную спираль с растущим концом цепи РНК. По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади — восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением РНК-полимеразы и ДНК. Трудно себе представить, как это может происходить в клетке, особенно при транскрипции хроматина. Поэтому не исключено, что для предотвращения такого вращения двигающуюся по ДНК РНК-полимеразу сопровождают топоизомеразы.

Элонгация осуществляется с пом.основных элонгирующих факторов, необходимых, чтобы процесс не останавливался преждевременно.

В последнее время появились данные, показывающие, что регуляторные факторы также могут регулировать элонгацию. РНК-полимераза в процессе элонгации делает паузы на определенных участках гена. Особенно четко это видно при низких концентрациях субстратов. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, т. н. паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. Продолжительность этих пауз может контролироваться факторами элонгации.

Терминация. У бактерий есть 2 мех-ма терминации транскрипции:

---ро-зависимый механизм, при котором белок Rho (ро) дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и мРНК, высвобождая молекулу РНК.

---ро-независимый, при котором транскрипция останавливается, когда только что синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов (…УУУУ), что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.

---Терминация транскрипции у эукариот менее изучена. Она завершается разрезанием РНК, после чего к её 3' концу фермент добавляет несколько аденинов (…АААА), от числа которых зависит стабильность данного транскрипта.

47. Факторы, влияющие на процесс транскрипции
Факторами транскрипции (другое название - специфические последовательности ДНК связующие факторы) в молекулярной биологии называют белки, связывающиеся с регуляторными участками ДНК с помощью своих ДНК-связывающих доменов и является частью системы, регулирует транскрипцию, то есть передачу генетической информации от ДНК к РНК ^{[1] [2]} .

Различные факторы транскрипции могут как способствовать связыванию РНК-полимеразы с промотором (в таком случае наблюдается активация транскрипции, а сам фактор называется «активатором»), так и предотвращать связывание РНК-полимеразы (в таком случае происходит репрессия транскрипции, а сам фактор называется «репрессором»). Факторы транскрипции выполняют такую ​​функцию либо самостоятельно, либо используя другие вспомогательные белки. В зависимости от функции, эти белки также делятся на «коактиваторы» и «корепресоры».

Прокариотическая рибосома

70S

50S 30S

 

5S и 23S рРНК 16S рРНК

34 белка 21 белок

 

Рибосома состоит из большой и малой субъединиц. Основу структуры каждой субъединицы составляет сложн образом свернутая рРНК. К каркасу из рРНК прикрепл рибосомн белки.

Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70S, отчего получили название 70S-частиц. Они построены из двух неодинаковых субчастиц: 30S- и 50S-субъединиц. Каждая субъединица представляет комплекс рРНК и рибосомных белков.

30S-частица содержит одну молекулу 16S-рРНК и в большинстве случаев по одной молекуле белка из более 20 видов (21). 50S-субъединица состоит из двух молекул рРНК (23S и 5S). В ее состав входят более 30 различных белков (34), также представленных, как правило, одной копией. Большая часть рибосомальных белков выполняет структурную функцию.

Эукариотическая рибосома

80S

60S 40S

 

5S; 5,8S и 28S рРНК 18S рРНК

не менее 50 белков не менее 33 белков

 

Рибосома состоит из большой и малой субъединиц. Основу структуры каждой субъединицы составляет сложн образом свернутая рРНК. К каркасу из рРНК прикрепл рибосомн белки.

Коэффициент седиментации полной эукариотической рибосомы составляет около 80 единиц Сведберга (80S), а коэффициент седиментации ее субчастиц составляет 40S и 60S.

Меньшая 40S-субчастица состоит из одной молекулы 18S-рРНК и 30-40 белковых молекул. Большая 60S-субчастица содержит три типа рРНК с коэффициентами седиментации 5S, 5,8S и 28S и 40-50 белков (например, рибосомы гепатоцитов крысы включают 49 белков).

Рибосомы: строение, финкция

Рибосомы являются цитоплазматическими центрами биосинтеза белка. Они состоят из большой и малой субъединиц, различающихся коэффициентами седиментации (скоростью осаждения при центрифугировании), выражаемые в единицах Сведберга – S.

Рибосомы присутствуют в клетках как эукариот, так и прокариот, поскольку выполняют важную функцию в биосинтезе белков. В каждой клетке имеются десятки, сотни тысяч (до нескольких миллионов) этих мелких округлых органоидов. Это округлая рибонуклеопротеиновая частица. Диаметр ее составляет 20—30 нм. Состоит рибосома из большой и малой субъединиц, различающихся коэффициентами седиментации (скоростью осаждения при центрифугировании), выражаемые в единицах Сведберга – S. Эти субъединицы объединяются в присутствии нити м-РНК (матричной, или информационной, РНК). Комплекс из группы рибосом, объединенных одной молекулой м-РНК наподобие нитки бус, называется полисомой. Эти структуры либо свободно расположены в цитоплазме, либо прикреплены к мембранам гранулярной ЭПС (в обоих случаях на них активно протекает синтез белка).

Полисомы гранулярной ЭПС образуют белки, выводимые из клетки и используемые для нужд всего организма (например, пищеварительные ферменты, белки женского грудного молока). Кроме этого, рибосомы присутствуют на внутренней поверхности мембран митохондрий, где также принимают активное участие в синтезе белковых молекул.

Свойства генетического кода

Генетич.код –с-ма записей наследственной информации в ДНК. В основу расшифровки ГК легла гипотеза последоват-ти, выдвинутая Криком, согласно которой последовательность нуклеотидов ДНК определяли последоват-ти аминокислот (АК) в белке (Б). Свойства:

1)ГК записывается в линейной форме, в виде нуклеотидов РНК, последоват-ть кот.комплементарна последоват-ти нуклеотидов ДНК

2)ГК триплетен. Поскольку в состав белка входит 20 АК, то ГК должен состоять не менее, чем из 3-х нуклеотидов. Триплетный код из 4-х типов нуклеотидов обеспечивает 64 различных кодона, т.е больше требуемых 20 АК. Нуклеотидные дуплеты могут образовать не более 16 кодонов, что недостаточно для кодирования 20 АК.

3)ГК универсален. Он используется практически всеми вирусами, эукариотами, простейшими. Вместе с тем количество и последовательность азот. оснований в цепи ДНК у разных организмов различается, что обеспечивает видовую специфичность

4 )ГК не перекрывающийся. Каждый рибонуклеотид входит в состав только 1 триплета

5)ГК непрерывный, т.е. он не использует внутренних знаков пунктуации. С началом трансляции кодоны мРНК считываются друг за другом без перерыва. При вставке или выпадении нуклеотидов нарушается считывание всего текста

6)ГК вырожденый - это такой код, в котором,1-й АК соответствует несколько кодонов. В ГК 18 из 28 АК соотвествует несколько триплетных кодонов. 3АК(аргенин, серин, лейцин) кодируются 6-ю триплетами; 5АК- 4-мя кодонами. Изолейцин - 3-мя, 9 АК - 2-мя кодонами….61 триплет из 64 является кодирующим

7)Имеются сигналы «стоп» и «старт». Это кодоны, которые инициируют и завершают трансляцию. Кодоны АУГ и ГУГ, если они стоят в начале текста, то это инициирующие кодоны. Кодовые группы УАА,УГА,УАГ являются терминирующими кодонами, т.е они не кодируют АК и называются бессмысленными кодонами (нонсэнс-кодоны). Крик сформировал гипотезу качания. Он предположил, что для взаимодействия с тРНК наиболее важны 2 первые АК. Существует 8 групп кодонов, которых 3-положение м.б занято любым нуклеотидом.Расшифровка ГК была завершена к 1967, было сформировано правило вырожденности ГК, которое гласило: если у 2-х триплетов 2 первые нуклеотидные последов-ти одинаковы, а 3-ий принадлежит к первому классу, то они кодируют 1 и ту же АК

 

Ретротранспозоны без ДКП

В перемещении таких ретротранстозонов участвуют ферменты обратная транскриптаза и интеграза. Механизм перемещения ретротранспозонов без ДКП включает обратную транскрипцию. На начальном этапе транспозиции происходит транскрипция ретротранспозона. Об­разовавшаяся РНК служит матрицей для синтеза белков, участ­вующих в перемещении ретротранспозона без ДКП. В тоже время РНК-копия ретротранспозона, связываясь в области раз­рыва ДНК с одной из ее цепей, выступает в качестве 80. матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК при участии обратной транскриптазы. После завершения синтеза этой цепи ДНК РНК удаляется и достраивается вторая цепь ДНК.

Ретротранспозоны без ДКП могут участвовать в образова­нии теломер у хромосом. Синтез теломер у многих эука­риотических организмов осуществляет теломераза. Однако у ряда насекомых активность этого фермента отсутствует. В связи с этим функцию синтеза теломер у них выполняют ретротранс­позоны без ДКП. Таким образом, ретротранспозоны без ДКП обеспечивают целостность хромосомы.

 

Значение исследований генетических процессов для различных отраслей человеческой деятельности

У спех достигнут в секвенировании генома в патоген организмов и переносчиков заболеваний.Это представляет интерес для профилактики лечения, диогностики заболеваний. Уже секвенировано около 30 геномов микроорганизмов. Изучены практически все геномы вирусов и почти все белок-кодирующие районы геномов прокариот. Расшифровка вирусных геномов, значение механизмов инфецирования, репликации, формирование новых вирусных частиц позволяет проектировать антивирусные лекарства, разрушающие вирусный геном. Широкое использование ПЦР для идентификации орагизмов. Например ПЦР позволяет отслеживать и оценивать активность инфекционного процесса до и по ходу олечения вирусного гепатита С.

 

Выделение ДНК и РНК

Этапы выделения ДНК и РНК

1.Разрушение клеток.

2.Отделение нуклеиновых кислот от белков, полисахаридов и др. соединений.

3.Осаждение нуклеиновых кислот.

4.Анализ чистоты препарата.

В зависимости от организма выделяют ДНК используя различные методы разрушения клеток:

1.Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий – лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия.

2.Разрушение клеток животных и человека: пользуют протеиназами.

3.Для разрушения клеточных стенок растений – ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. используют обработку хелатирующими агентами, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счѐт связывания двухвалентных катионов.

2. Отделение нуклеиновых кислот от белков осуществляют:

- осуществляют с помощью фенола и хлороформа (белки переходят в фазу растворителя). смесь водонасыщенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование.

белки разрушают протеиназами, например, протеиназой К;

-центрифугированием для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл.

Ряд современных методов предусматривает(осаждение ДНК на гранулах силикагеля добавл гуанидинтиоцианат).

3.Оставшиеся НК в водном растворе осаждают раствор этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном р-ре.

4. Для оценки чистоты препарата ДНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК д.б. больше 1,8. Значение А260/235 должно быть больше, чем 2,2.

 

 

4. Геномная революция 1990-х гг. Вклад К. Вентера в развитие геномных исследований

В 1953 году Крик и Уотсон открыли двойную спираль ДНК, что дало толчок к полувековому развитию молекулярной биологии, завершившуюся осуществлением проекта «Геном человека».

Крейг Вентер был президентом компании Celera Genomics, занимавшейся параллельной коммерческой версией проекта «Геном человека». В этой компании в 1999 году использовался метод дробовика(используемый для секвенирования длинных участков ДНК. Суть метода состоит в получении случайной выборки клонированных фрагментов ДНК данного организма, на основе которых может быть составлена его геномная библиотека.). Целью проекта было создание генетических баз данных и их коммерческое использование. Вентер был вынужден раскрыть генетические данные и включить их в проект «Геном Человека». Несмотря на различие мотиваций и конкуренцию Ветер и Коллинз вместе обьявили, в июне 2000 года о «первой сборке генома человека». это была первая реконструкция полного генома человека, выполненная методом беспорядочной стрельбы. В феврале 2001 был опубликован первый предварительный набросок генома человека. (Изучение генома началось в 80-х годах. В последствии была создана Международная организация по изучению генома человека HUGO (Human Genome Organization)). Изучением генома занимабтся ученые США, Японии, ряда стран Европы, России и др.)

Цели проекта:

1.Идентефикация 20тыс-25тыс генов ДНК

2.Определение последовательности 3 млрд.пар химических оснований, составляющих ДНК человека, и сохранение этой информации в базе данных

3.Усрвершенствование приборов для анализа данных

4.Внедрение новейших технологий в область частного использования

5.Исследование этических, правовых и социальных вопросов, возникающих при расшифровке генома.

Проект состоит из 5 основных этапов:

1.Составление карты, на которой помечены гены, отстоящие друг от друга не более,чем на 2млн оснований с разрешением 2МБ(Мегабаза)

2.Завершение физич.карт каждой хромосомы с разрешением 0,1 Мб.

3.Получение карты всего генома в виде набора описанных по отдельности клонов.

4.К 2004г. полное секвенирование ДНК

5.Нанесение на карту с разрешением в 1 основание всех генов человека.

В ходе проекта создают три типа карт хромосом: генетические, физические и секвенсовые.