Особенности репликации у эукариотических организмов

Синтез ДНК у эукариот происходит в S-фазу клеточного цикла. Инициацию репликации регулируют специфич.сигнальные белки –факторы роста,кот.передают сигнал, побуждающий кл.к началу репл.

Репликация начинается на определённом сайте молекулы ДНК, точке начала репликации или ori-сайте. В этой точке двойная спираль ДНК расплетается с обр двух репликативных вилок, которые движутся по направлению др.к др.

В формиров.репликативных вилок участвуют ДНК-топоизоимеразы и ДНК-хеликазы. ДНК-топоизомераза 1 разрывает фосфодиэфирную связь одной цепи ДНК и ковалентно присоединяется к 5/-концу точки разрыва.По окончанию формирования репликативной вилки фермент ликвидирует разрыв и отделяется от ДНК.

Разрыв водородных связей в двуцепочечной молекуле ДНК осуществляет фермент ДНК-хеликаза с использованием энергии макроэргических связей АТФ. В рез.происходит раскручивание суперспиральтной стр-ры ДНК,в подержании такой стр-ры участвуют SSB-белки. Элонгация – продолжение репликации. Репликация ДНК осущ-ся ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами. Субстартами для синтеза новой цепи ДНК явл. дезоксинуклеозид-трифосфаты. (дГТФ (dGTP), дАТФ (dATP), ГТФ (TTP), дЦТФ (dCTP)). Эти же соединения служат источниками энергии. На образование каждой связи расходуются две макроэргические связи. Участвуют ионы магния, нейтрализуя отрицат. заряд нуклеотидов.

У эукариот принимают участие 5 ДНК полимераз (α, β, γ, δ, ε), - различаются по числу субъединиц, молекулярной массе, способности взаимодействовать с другими белками и ф-циональному назначению. Полимеразы β, δ и ε не могут начинать образование дочерней ДНК, т.к. не имеют сродства к одиночной цепи ДНК.Начинает репликацию полимераза α, кот.синтезирует небольшой фрагмент РНК-праймер и далее примерно 60 нуклеотидных остатков ДНК. Образующийся небольшой двухцепочечный фрагмент позволяет присоединиться полимеразе δ и продолжить синтез новой цепи в направлении от 5/ к 3/. Выбор очередного нуклеотида определяется матрицей ДНК. При созревании отстающей цепи ДНК праймеры удаляют ДНК-полимераза β и присоединяет недостающие нуклеотиды. Восстановленные фрагменты соединяют ДНК-лигазы. В отстающей цепи синтез фрагмента оказаки катализирует полимераза ε.

ДНК хромосомы человека содержит примерно 150 млн. пар нуклеотидов. Репоикация такой болдьшой молекулы со скоростью 50 нуклеотидов в минуту шла бы примерно 8 часов, поэтому инициация синтеза ДНК происходит в нескольк.сайтах хромосомы.(ori-сайтах, origin, ориджин). Эти сайты имеют определённую нуклеотидную последовательность. Последовательность ДНК, ограниченная двумя ori-сайтами называется репликоном или единицей репликации. На ориджинах при участии ДНК-топоизомеразы 1 образуются две репликативные вилки.

25. Составляющие элементы процесса репликации (на примере бактерий)

В 1956 Артур Корнберг наработал 100 кг биомассы бактерий E.coli и выделил только 0,5 г фермента ДНК-полимеразы.

Основные компоненты для синтеза ДНК in vitro:

1. ДНК-матрица - образец, по которому строится новая цепь ДНК.

2. Дезоксирибонуклеотиды (АТФ, ГТФ,ТТФ,ЦТФ) - то, из чего строятся дочерние цепи.

3. ДНК-полимераза – фермент, осуществляющий синтез ДНК.

4. Ионы магния – необходимы для работы фермента.

Нативная двуцепочечная ДНК, не имеющая повреждений, не может эффективно использоваться для репликации. Активировать ее можно либо денатурацией щелочью или нагреванием, либо обработкой нуклеазой определенного типа, которая делает однонитчатые концы, либо внесением одноцепочечных разрывов с помощью эндонуклеаз Во всех случаяхматрицей для синтеза новых цепей служит одноцепочечная ДНК. Затравкой является 3'-ОН конец двуцепочечной ДНК, причем он должен быть спарен с матрицей.

Составляющие элементы процесса репликации.

Топоизомеразы – топоизомераза I и топоизомераза II

Для подготовки хромосомы к репликации работают:

Непосредственно в процессе репликации участвуют ферменты:

1. Хеликазы

2. Белки инициации репликации DnaА, DnaB, DnaС

3. SSB-белки

4. ДНК-праймаза (РНК-полимераза)

5. ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза I ДНК-полимераза II ДНК-полимераза III

6. ДНК-лигаза

 

 

26. Основные функции ферментов репликации

•ДНК-топоизомеразы - ферменты изменяющие степень сверхспирализации ДНК, путем внесения одноцепочечных или 2хцепочечных разрывов в ДНК.

•ДНК-хеликаза – фермент разделяющий цепи 2хцеп ДНК на одинарные цепи.

•ДНК-праймаза — это фермент РНК-полимераза, синтезирующий короткий фрагмент РНК, наз праймером, комплементарный 1цеп матрице ДНК.

•ДНК-полимеразы - ферменты катализирующие синтез дочерних цепей на матрице ДНК по принципу комплементарности.

•ДНК-лигаза– фермент катализирующий сшивание 1цеп.фрагм.ДНК.

Топоизомеразы. ДНК-топоизомеразы, находясь перед репликативной вилкой, разрезают молекулу ДНК для облегчения ее расплетания и раскручивания молекулы ДНК, после чего непрерывность ее восстанавливается. По механизму действия топоизомеразы делятся на два типа:

Топоизомераза I путём одноцепочечного разрыва создает шарнир, вокруг кот.молекула ДНК, находящаяся перед вилкой, может свободно вращаться.Это снимает механическ.напряжение, возникающее при раскручивании двух цепей в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения. Топоизомераза I уменьшают число сверхвитков в ДНК на единицу за один акт. Топоизомераза II вносит временные разрывы в обе комплиментарные цепи ДНК, пропускает двухцепочечный сегмент той же самой или другой мол ДНК через разрыв, а затем соединяют разорванные концы. В рез.за один акт снимаются два сверхвитка.

Хеликазы – ферменты, способные расплетать две комплементарные нити в ДНК с использованием энергии, полученной при гидролизе АТФ. У бактерий имеется 2 хеликазы–хеликаза Rep и хеликаза DnaB. Считается,что хеликаза,движимая гидролизом АТФ, однонаправлено едет по одной из цепей ДНК,расплетая й двойную спираль.

Хеликаза Rep продвигается от 3'-конца к 5'-концу цепи ДНК, служащей матрицей для ведущей цепи ДНК.

Хеликаза DnaB продвиг по противоположной цепи, служ для синтеза запазд цепи. Продвижение хеликаз идет в направлении вместе с реплик вилкой.

Роль ssb-белков заключается в том, что они связываются с однонитчатой ДНК, выпрямляют ее и блокируют образование шпилечных двухнитчатых структур. SSB-белки обнаружены в 1968 г. Они снижают температуру

плавления ДНК in vitro на 20-40оС. Эти белки связываются с

ДНК электростатически. Они удерживают матричные цепи ДНК в репликативной вилке в одноцепочечном состоянии, а также защищают одноцепочечную ДНК от действия нуклеаз.

Праймаза – фермент, синтезирующий РНК-праймеры для запуска синтеза ведущей цепи ДНК и запуска синтеза фрагментов Оказаки на запазд цепи ДНК. Праймаза активируется ДНК-хеликазой и нах с ней в комплексе, кот наз праймасомой. Без РНК-праймеров синтез ДНК начаться не может.

 

27.Экзонуклеазные реакции ДНК-полимеразы I. 3’→ 5’-экзонуклеазная активность

Кроме полимеризации ДНК-пол.I катализирует две другие реакции. В ходе одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной из цепей ДНК, начиная с 3’-конца цепи (3’→ 5’-экзонуклеазная активность), причем, за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3’-конца цепи.

5’→ 3’-экзонуклеазная активность ДНК-пол.I

Вторая реакция также заключается в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз идет с 5’-конца цепи ДНК к 3’-концу (5’→ 3’-экзонуклеазная активность).

Различные активности ДНК-пол.I принадлежат разным участкам полипептидной цепи с молекулярной массой 109 000 дальтон.

Большой С-концевой участок (76 000 дальтон) проявляет 5’→3’-

полимеразную и 3’→ 5’-экзонуклеазную активности.

Малый, N-концевой, фрагмент (36 000 дальтон) обладает только

5’→ 3’-экзонуклеазной активностью.

Большой фрагмент называется также фрагментом Кленова, он способен инициировать репликацию in vitro. 3’→ 5’-экзо-нуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого последующего нуклеотида и удаление ошибочно вставленного нуклеотида с растущего конца цепи ДНК. С помощью 5’→ 3’-экзонуклеазной активности вырезаются праймеры.

Ник-трансляция ДНК-пол. I способна удлинять 3’-конец одной из цепей ДНК в месте разрывов и одновременно удалять нуклеотиды с 5’-конца того же разрыва- никтрансляция. Он играет ключевую роль в репарации повреждений ДНК.

•В клетке E. coli имеется несколько сотен молекул ДНК-пол.I.-имеет большее отношение к созреванию реплицирующейся ДНК, чем непосредственно к полимеразным процессам в репликативной вилке.

•ДНК-полимераза I и присущие ей экзонуклеазные активности играют большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК Е. coli. Экзонуклеазная активность 3' → 5' обеспечивает контроль за рисоединением каждого НК и удаление ошибочных нуклеотидов с растущего конца цепи.

 

 

28. ДНК-пол. II (мол.масса 90 кДа) представлена одной

полипептидной цепью, обладает полимеразной и 3’→ 5’-экзонуклеазной активностями. Она плохо соединяется с одноцеп-ми ДНК, но лучше работает с биспиральной ДНК, имеющей одноцепоч. бреши длиной в неск.десятков нуклеотидов, обладает лишь 10 %-й ДНК-полимеразной активностью по сравнению с ДНК-полимеразойI.

Предполагают, что основной функцией ДНК-полимеразы II является

достраивание поврежденных участков в молекуле ДНК- репарация.

Она может заполнять пробелы между фрагментами ДНК за счет

полимеразной активности, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки (т.к. не обладает 5’→3’-экзонуклеазной активностью) или осуществлять ник-трансляцию.