Альтернативный сплайсинг или дифференциальный процессинг.

Альтернативный сплайсинг – это образование разных видов иРНК на основе одной незрелой РНК, т.е. - сплайсинг весьма пластичный процессс. Несколько экзонов, содержащихся в гяРНК могут сшиваться в разных комбинациях с образованием различных матричных последовательностей (рис.34). Этот кажущийся расточительным способ передачи информации развился у эукариот потому, что он делает процесс синтеза белка значительно более гибким. Например, первичные транскрипты РНК одного и того же гена могут подвергаться сплайсингу разными способами, давая разные иРНК в зависимости от типа клетки или стадии развития. Это позволяет производить разные белки под контролем одного и того же гена. В парафолликулярных клетках щитовидной железы в ходе транскрипции гена кальцитонина, образуется иРНК, которая содержит информацию о гормоне, в нейронах мозга тот же первичный транскрипт подвергается другому варианту сплайсинга, в результате чего иРНК кодирует белок, ответственный за вкусовое восприятие. Алтернативный сплайсинг характерен и для генов, кодирующих белки, участвующие в мышечных сокращениях, формировании цитоскелета, нервных волокон, молекул иммуноглобуллинов, пептидных гормонов и т.д.

Рис. 34. Типы альтернативного сплайсинга иРНК. А – альтернативные промоторы, Б – альтернативные области полиаденирования, В – возможные комбинации экзонов. Темные участки – экзоны, светлые – интроны, сплошные и пунктирные линии показывают возможные соединения экзонов. (А. С. Коничев, Г. А. Севастьянова, 2005, с. 293)

 

Кроме того, наличие многочисленных интронов облегчает генетическую рекомбинацию между экзонами. А это имело большое значение на ранних этапах эволюции, когда была возможность синтезировать новые белки из частей ранее существовавших, вместо того чтобы вырабатывать целиком новые последовательности.

Дифференциальный процессинг РНК, как показали недавние исследования, играет основную роль в детерминации полового фенотипа дрозофилы. Известно, что в развитии полового фенотипа у дрозофилы участвуют группы генов, которые преобразуют отношение Х – хромосома аутосома в мужской или женский тип. Одним из ключевых генов в этом процессе является ген – transformer. Этот ген необходим для дифференцировки самок, и его утрата приводит к появлению самцов независимо от соотношения хромосом. На протяжении всего личиночного периода ген transformer активно синтезирует транскрипт, который проходит процессинг в неспецифическую иРНК (имеющуюся у самок и самцов). Только самки содержат иРНК, образованную при альтернативном сплайсинге, и она является единственной функциональной иРНК, синтезируемой этим геном. В формировании альтернативных иРНК могут быть задействованы три основных механизма:

1. использование разных промоторов (рис.34 А)

2. изменение сайта полиаденилирования первичного транскрипта (изменяется структура и размеры 3' – концевого участка пре – иРНК) (рис.34 Б)

3. перестановка экзонов (рис. 34 В)

Следует отметить, что процессинг у эукариот включает в себя кроме сплайсинга также процесс кепирования и полиаденилирования.

Трансляция

Трансляция – важнейший этап реализации генетической программы клеток. В процессе трансляции информация, закодированная в первичной структуре нуклеиновых кислот, переводится в аминокислотную последовательность синтезируемых белков.

Трансляция /translation - перевод/ - это перевод информации с 4-буквенного алфавита нуклеотидов на язык аминокислот с 20-буквенным алфавитом. Точность такого перевода (колинеарность) обеспечивает правильную расстановку амино­кислот в образующейся полипептидной цепи. В процессе трансляции, наряду с иРНК, участвуют молекулы тРНК, рибосомы и др. Ин­формация об аминокислотной последовательности каж­дого белка записана в виде последовательности кодонов в со­ответствующей иРНК, т.е. в виде генетического кода.

Генетический код – система расположения нуклеотидов в молекуле ДНК и иРНК, контролирующая последовательность расположения аминокислот в белке. В 1954г. Г.А. Гамовым было высказано предположение, что кодирование информации в молекуле ДНК должно осуществляться сочетанием нескольких нуклеотидов. Триплетность генетического кода была доказана Ф. Криком.

Свойства генетического кода

Свойства генетического кода:

1. генетический код триплетный, т.е. 3 нуклеотида кодируют 1 аминокислоту. Триплет иРНК получил название кодона, а ДНК – генона.

2. генетический код вырожденный, т.е. одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими (до 6) триплетами. Ответа на вопрос: «Почему разные аминокислоты кодируются разным числом триплетов» наука не имеет, но биологическое значение этого свойства раскрыто:

· оно позволяет разнообразить генетический материал. Например, один и тот же белок у бактерии E. coli и вируса табачной мозаики записаны разными триплетами.

· разные триплеты неоднозначно распознаются, что влияет на скорость синтеза белка рибосомами.

· повышается надежность кодирования информации

3. Генетический код неперекрывающийся, т.е. нуклеотиды предыдущего триплета не могут быть началом следующего. Считывание идет в одном направлении триплет за триплетом.

4. Генетический код универсален, он един для всех организмов: растений, животных, бактерий и вирусов (исключение – генетический код митохондрий, где несколько кодонов меняют смысл).

5. Генетический код уникален, т.е. один триплет кодирует только одну аминокислоту.

6. Генетический код эволюционно заморожен, т.е. все возможные варианты триплетного генетического кода природой созданы.

 

Таблица 2.

Словарь генетического кода.

Первая буква	Вторая буква	Третья буква
У	Ц	А	Г
У	УУУ фен УУЦ УУА лей УУГ	УЦУ сер УЦЦ УЦА УЦГ	УАУ тир УАЦ УАА-стоп УАГ-стоп	УГУ цис УГЦ УГА-стоп УГГ три	У Ц А Г
Ц	ЦУУ ЦУЦ лей ЦУА ЦУГ	ЦУУ ЦЦЦ про ЦЦА ЦЦГ	ЦАУ гис ЦАЦ ЦАА глн ЦАГ	ЦГУ ЦГЦ ЦГА арг ЦГГ	У Ц А Г
А	АУУ АУЦ илей АУА АУГ мет	АЦУ АЦЦ тре АЦА АЦГ	ААУ ААЦ аспн ААА ААГ лиз	АГУ АГЦ сер АГА АГГ арг	У Ц А Г
Г	ГУУ ГУЦ вал ГАУ ГУГ	ГЦУ ГЦЦ ГЦА ала ГЦГ	ГАУ ГАЦ асп ГАА ГАГ глу	ГГУ ГГЦ гли ГГА ГГГ	У Ц А Г

 

 

Таблица 3.

Аминокислоты и их обозначение.

Название кислоты	Принятые сокращения	Название кислоты	Принятые сокращения
Аланин	Ала	Лейцин	Лей
Аргинин	Арг	Лизин	Лиз
Аспаргиновая кислота	Асп	Метионин	Мет
Аспаргин	Асн	Пролин	Про
Валин	Вал	Серин	Сер
Гистидин	Гис	Тирозин	Тир
Глицин	Гли	Треонин	Тре
Глутамин	Глн	Триптофан	Три
Глутаминовая кислота	Глу	Фенилаланин	Фен
Изолейцин	Иле	Цистеин	Цис

 

Полная расшифровка генетического кода, проведенная М. Ниренбергом, С. Очао и Н.Г. Корана с использованием бесклеточных систем, содержащих рибосомы и специальные синтетически полученные матрицы, была закончена в 1966г. Эта работа показала, что 61 из 64 возможных сочетании трех нуклеотидов (4³=64) кодируют одну из 20 аминокислот. Три кодона – УАА, УГА, УАГ – не кодируют ни одну аминокислоту. Эти кодоны являются стоп – кодонами или терминирующими кодонами. Терминирующие кодоны не всегда однозначно распознаются системой трансляции и поэтому в составе и-РНК они нередко дублируются. Первым (основным) стоп – кодоном обычно является УАА, а на небольшом расстоянии следом за ним располагается УГА или УАГ.

Поскольку число кодирующих триплетов в 3 раза больше числа аминокислотных остатков, многие аминокислоты кодируются несколькими (от 2 до 6) кодонами (вырожденность генетического кода). Только две аминокислоты – метионин и триптофан – кодируются одним кодоном – АУГ и УГГ соответственно.

Вырожденность генетического кода проявляется в том, что для каждой аминокислоты существует более одной тРНК, и одна тРНК может взаимодействовать более чем с одним кодоном иРНК.В связи с преобладающей ролью первых двух букв кодонов (считая с 5' конца триплета иРНК) генетический код иногда называют квазидуплетным (псевдодуплетным). Эта особенность кода позволяет использовать меньшее число тРНК – вместо 61 вида тРНК всего 31 тРНК в цитоплазме и 22 тРНК в белок синтезирующей системе митохондрий. Это свойство генетического кода лежит в основе защиты живых организмов от проявления примерно 30% мутаций за счет уоблинг – эффекта. Уоблинг – эффект это такое взаимодействие кодона иРНК и антикодона тРНК, при котором два первых нуклеотида кодона и антикодона строго комплементарны, а третий может колебаться.

 

Таблица 4.

Взаимодействие иРНК и тРНК в норме и при уоблинг – эффекте.

 

	Норма	Мутация
и-РНК	ГУУ	ГУГ
т-РНК	ЦАА	ЦАА
АК	Лейцин	Лейцин

 

Как видно из таблицы 4, несмотря на то, что в результате мутации в иРНК произошла замена 3 нуклеотида У на Г, в аминокислотную цепь благодаря уоблинг – эффекту встраивается одна и та же аминокислота, т.е. нет изменений в аминокислотной цепи, следовательно нет в белке и признаке. В настоящее время нет никаких данных о том, что когда - либо на Земле существовали организмы с другим кодом или другими аминокислотами. Очевидно, генетический код тщательно сохраняется в эволюции и изменения в коде и рибосомальном аппарате клеток сильно заторможен.

Активация аминокислот.

Аминокислоты сами по себе не способны узнавать кодоны в иРНК. Поэтому перед началом трансляции они должны пройти стадию активации и присоединиться к тРНК, которые осуществляют их доставку к рибосомам. Следует напомнить, что тРНК служат адаптерами при переводе нуклеотидных последователей иРНК в аминокислотные последовательности белка в соответствии с правилами генетического кода. В структуре тРНК главными для адаптерной функции являются два центра – а нтикодон и акцептирующий конец (рис.26). В результате специфического взаимодействия тРНК и соответствующей аминокислоты возникает аминоацил тРНК. Для каждой аминокислоты существует своя особая аминоацил – тРНК – синтетаза (АРСазы). АРС – азы, присоединяя аминокислоту к тРНК со строго определенным антикодоном, как бы сообщают аминокислоте определенный шифр в виде трех нуклеотидов антикодона тРНК и поэтому эти ферменты называют кодазами или шифразами. Выдающаяся роль АРС – аз в безошибочном синтезе полипептидных цепей белков была доказана в специальных экспериментах с использованием бесклеточных систем белкового синтеза и в опытах с мечеными соединениями.

Образование комплекса аминокислота – тРНК идет в несколько этапов:

1. образование активированной формы фермента

АРС-аза+АТФ → АМФ~АРС-аза+АДФ – пирофосфат

Активированная форма фермента

2. присоединение к тРНК специфичной аминокислоты

АМФ~АРС-аза+тРНК+АК → АК~тРНК+АРС-аза

3. проверка правильного соединения аминокислоты со специфичной тРНК.

Надежность связывания аминокислоты с тРНК обеспечивается двумя центрами кодаз: один отвечает за присоединение аминокислоты, другой распознает неправильно присоединенную аминокислоту и удаляет ее. Следует добавить, что ошибки, допускаемые АРС-азами при синтезе аминоацил-тРНК, очень редки и происходят не чаще чем 1 на 10 000 реакции.

 

 

Рис.35.Этапы синтеза белка. (пояснения в тексте). (Б. Альбертс и др., 1994, т. 3, с. 250)

 

Различают три фазы (этапы) трансляции: инициацию, элонгацию и терминацию (рис.35).

1. Инициация.

Необходимым условием инициации является формирование инициирующего комплекса, состоящего из малой субъединицы иРНК и инициирующей тРНК. Осуществление процесса инициации оказывается возможным благодаря двум особенностям иРНК: 1) в молекуле иРНК имеется кадон АУГ (у про- и эукариот) и ГУГ (у прокариот), который является стартовой точкой и определяет рамку считывания; 2) наличие в иРНК определенной последовательности, которая ответственна за связывание иРНК с рибосомой, и она всегда предшествует началу кодирующей области

Для инициации трансляции необходимы:

1. инициирующий (стартовый) кодон иРНК; 2. инициаторная аминоацил т-РНК; 3. белковые факторы инициации (в данном курсе не рассматривается).

Сначала происходит присоединение малой субъединицы рибосомы к и-РНК и узнавание инициирующего (стартового) кодона. Стартовыми кодономи является ближайшие к КЕП иРНК кодоны АУГ (у про- и эукариот) и ГУГ (у прокариот) и ни один из других триплетов АУГ или ГУГ, расположенных в кодирующей области и-РНК не может быть использован в качестве инициирующего.

Обязательным условием выбора старт – кодона иРНК является его соответствующее нуклеотидное окружение, т.е. определенные нуклеотиды должны быть перед и после старт – кодона. Перед началом трансляции у эукариот последовательности иРНК как бы сканируется (просматривается) начиная с 5' конца (КЭПа) для поиска старт – триплета, расположенного в выше отмеченном оптимальном нуклеотдном окружении.

Затем к старт – кодону иРНК присоединяется инициаторная тРНК. Спаривание антикодона инициаторной тРНК со старт – кодоном иРНК имеет принципиально важное значение, т.к. это взаимодействие определяет рамку считывания трансляции. На иРНК может быть установлена только одна рамка считывания. Сдвиг рамки считывания приводит к синтезу измененного белка и нарушению признака.

Малая субъединица не может самостоятельно связываться ни с иРНК, ни с тРНК. Для этого требуются белковые факторы инициации, которые более разнообразны и многочисленны у эукариот. После образования комплекса малая субъединица рибосомы, иРНК и инициаторная тРНК, к малой субъединице рибосомы присоединяется большая субъединица, т.е. завершается процесс сборки функционально активной рибосомы. Объединение субъединиц рибосомы приводит к формированию двух центров связывания тРНК: А и Р – центров.

А – центр (аминоацильный центр) и Р – центр (пептидильный центр). Они компактны, и расположены рядом друг с другом и образуют функциональный центр рибосомы (ФЦР). В А – центре происходит взаимодействие кодона иРНК и антикодона аминоацил тРНК, а в Р- центре – пептидил – тРНК. В большой субъединице находится Т – центр или пептидилтрансфазный центр, в нем идет синтез пептидной связи между аминокислотами (активен только в полной рибосоме).

Следует отметить, что в процессе сборки активной (транслирующей рибосомы инициаторная тРНК со своей аминокислотой закрепляется в Р – центре), а А – центр свободен и готов для присоединения следующей аминоацил тРНК.

Таким образом, этап инициации трансляции включает следующие стадии:

1. взаимодействие малой субъединицы рибосомы с иРНК;

2. присоединение инициаторной аминоацил – тРНК к старт – кодону;

3. объединение большой и малой субъединиц рибосомы и формирование на ней А, Р и Т – центров;

4. закрепление инициаторной тРНК в Р – центре;

Следует отметить, что это одна из возможных моделей инициации трансляции. Есть и другие способы инициации.

II. Элонгация – рост аминокислотной цепи.

В свободный А – центр рибосомы встраивается аминоацил тРНК, антикодон которой комплементарен кодону иРНК. Аминокислоты оказываются в Т – центре рибосомы и между ними образуется пептидная связь. В результате образования пептидной связи аминокислота, связанная с тРНК Р – зоны, разрывает с ней связь и переносится на свободную аминогруппу аминокислоты, связанной с тРНК А – зоны. В результате этой реакции образуется дипептидил – тРНК (т.е. тРНК А – зоны содержит две аминокислоты). Освободившаяся от аминокислотного остатка тРНК Р – центра удаляется из него во время колебания субъединиц рибосомы (вспомним: рибосома двигается по иРНК «шагами», длина которого равна одному триплету). Одновременно освобождается А – центр, т.к. дипептидил тРНК оставаясь связанным с кодоном иРНК, перемещается из А – центра в Р – центр рибосомы. А – центр свободен и в него по принципу комплементарности кодона и-РНК и антикодона тРНК встраивается новая тРНК со своей аминокислотой. Многократное последовательное воспроизведение всех стадии элонгации приводит к росту аминокислотной цепи.
доставка различных аминоацил-тРНК к рибосоме происходит не спонтанно, а при непосредственном участии белковых факторов элонгации.

Таким образом, цикл элонгации включает 3 этапа: 1) связывание аминоацил-тРНК в А-центре рибосомы; 2) образование пептидной связи; 3) транслокации.

III.Терминация трансляции происходит, когда в А – центре рибосомы появляется стоп – кодон (или кодон терминатор), который не кодирует ни одну аминокислоту. С кодоном терминации сразу же связываются белковые факторы терминации, это приводит к гидролизу сложноэфирной связи между С – концом синтезированного полипептида и акцептирующим концом тРНК. В результате синтезированный белок отделяется от рибосомы, одновременно отдаляется тРНК и иРНК, а сама рибосома диссоциирует на большую и малую субъединицы. Трансляция закончена. В результате трансляции образуется первичная и вторичная структура белка.

На этапе трансляции точность белкового синтеза обеспечивается двумя различными механизмами и декодирование зависит от:

1. связывания аминокислоты с тРНК

2. связывание кодона и антикодона

Ошибки в процессе трансляции в среднем составляют 1:10^-4 аминокислот, т.е. на каждые 10⁴ аминокислот включается одна неправильная аминокислота. В белке из 400 аминокислот 1 ошибка приходится на 25 синтезированных белков.

Процесс трансляции может быть нарушен:

1. В процессе транскрипции

2. В результате мутаций в гене рРНК, пептидилтрансферазы, белков рибосом, отвечающих за расстановку тРНК в рибосоме

3. В процессе нарушения в факторах:

a. инициации

b. элонгации

c. терминации

Скорость синтеза белка у прокариот при температуре 37° С 12 – 17 аминокислоты/секунду, у эукариот - 1 – 2 аминокислоты/секунду.

Рис. 36. Различия в транскрипции и трансляции у прокариот (А) и эукариот (Б)

 

4. Процессинг белка – процесс созревания белковой молекулы. В этом процессе участвуют ЭПС, аппарат Гольджи, лизосомы. Многие белки синтезируются в неактивном состоянии и для их активации необходимо действие ферментов, которые модифицируют структуру молекулы.

Многие мембранные белки синтезируются в виде пре-белков. Они имеют на N-конце лидерную последовательность, которая обеспечивает узнавание мембран и встраивание внутрь.

Секреторные белки – имеют на N конце лидерную последовательность, которая обеспечивает их транспорт через мембрану.

Иногда такой процесс многоступенчатый и каждый продукт оказывает свое действие. Например, в аркуатном ядре промежуточного мозга вырабатывается полипептид – пропиомеланокортин, образованный 265 аминокислотами. Это вещество непосредственно участвует в процессах памяти, однако оно может транспортироваться по аксонам в нейроны других отделов ЦНС, где из него образуются совершенно другие низкомолекулярные полипептиды обладающие другими биологическими эффектами (гормоны, вещества регулирующие жировой обмен, обладающие обезболивающим действием и т.д.).

На этом этапе, на формировании окончательной структуры белка, на его активность оказывают влияние факторы внешней среды. Даже при строго коллинеарном полипептиде возможно отклонение в структуре белка под влиянием отдельных факторов внешней среды. Поэтому у больной матери, даже при наличии нормального генома у ребенка, он может родиться больным, т.к. возможно отклонение в структуре белка под влиянием отдельных факторов среды.

Следует отметить, что все стадии транскрипции и трансляции жестко контролируются и регулируются (рис.37).

Рис. 37. Этапы контроля реализации наследственной информации. (Б. Альбертс и др, 1994, т. 3, с. 289)