Опыт 2. Определение изоэлектрической точки желатина

Природные белки в зависимости от аминокислотного состава могут быть кислыми или основными. Большинство природных белков относится к кислым или слабокислым, за исключением протаминов и гистонов, которые содержат избыток диаминомонокарбоновых кислот (аргинин, лизин, гистидин, обуславливающих щелочной характер белков)

Изменяя концентрацию водородных ионов в среде при добавлении буферных растворов с заданным рН, можно изменить константу диссоциации белка как кислоты так и основания. Схематично это можно представить следующим образом:

 

СОО^- +Н⁺ СООН +Н⁺ СООН

Белок - СОО^- Белок - СОО^- Белок - СООН

NН₃ ⁺ NН₃⁺ NН₃⁺

Анион белка Катион белка

⁺NH₃ +ОН^_ NH₂ +ОН^_ NH₂

Белок - СОО^- Белок - СОО^- Белок - СОО^-

⁺NН₃ ⁺NН₃ NН₂

Катион белка Анион белка

Однако при определенном значении рН среды (неодинаковом для различных белков) степень кислотной диссоциации белковой частицы станет равной степени диссоциации белковой молекулы как основания, т.е. число отрицательных зарядов белковой молекулы сравняется с числом положительных зарядов. Заряд такой молекулы в целом практически равен нулю. Такое состояние белка называется изоэлектрическим, так как в электрическом поле такой белок не будет продвигаться ни к катоду ни к аноду. Значение рН раствора, при котором белок находится в изоэлектрической состоянии, называется изоэлектрической точкой.

Изоэлектрическая точка является характерной константой белков и зависит от аминокислотного состава белковой молекулы.

Растворы белков в изоэлектрической точке вследствие электронейтральности молекул белка наименее устойчивы, легко осаждаются. В качестве стабилизирующего фактора остается только гидратная оболочка. Присутствие солей может либо увеличить, либо уменьшить растворимость того или иного белка.

Ход работы:

Для определения берут 6 пробирок. В каждую из них помещают по 6 мл буферной смеси, пользуясь таблицей 2.

Таблица 2

Объемы сливаемых растворов, мл

 

Раствор, мл	Номер пробирки
.
СН3СООNa, 0,1 н
СН3СООН, 0,1 н.	0,25	0,50				-
СН3СООН, 1 н.	-	-	-	-	-	0,8
Дистиллированная вода	3,75	3,50			-	3,2

 

Тщательно перемешивают содержимое пробирок и добавляют в каждую из них по 2 мл 1%-ного раствора желатина. Затем в пробирку №4 медленно, при помешивании добавляют столько этилового спирта, чтобы спустя некоторое время оставалась едва заметная муть. Обычно для этого требуется 8 мл спирта. Во все остальные пробирки прибавляют при помешивании точно столько же спирта сколько прибавлено в пробирку № 4. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 20-30 мин. Спустя это время во всех пробирках появляется помутнение. Наибольшее помутнение наблюдается в той пробирке, рН в которой соответствует изоэлектрической точке желатина.

Результаты наблюдений записывают в виде таблицы 3. В графе «Степень коагуляции» отсутствие помутнения обозначают знаком (-), наличие его - знаком (+), значительное помутнение - несколькими плюсами.

 

Таблица 3

Результаты определения изоэлектрической точки желатина

 

Параметр	Номер пробирок
рН раствора	5,6	5,3	5,0	4,7	4,4	4,1
Степень коагуляции

Вывод: