Препаративныи электрофорез белков

Электрофорез в ПААГ не получил широкого распространения
в качестве препаративного метода фракционирования и очистки
белков. Одна из причин этого, по-видимому, состоит в трудности
осуществления равномерного теплоотвода из большой массы ге-
ля любой конфигурации (цилиндрической, кольцевой или плос-
кой). Неравномерность теплоотвода и возникающие в геле гра-
диенты температуры приводят, как уже отмечалось, к резкому
ухудшению качества разделения белков.

Вторая трудность связана с необходимостью создания удоб-
ной и надежной камеры элюции для сбора белков по мере их
последовательного выхода из геля. В многочисленных конструк-
циях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру соз-
давали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от
нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохране-
ния качества разделения белков камера элюции очень малого
объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться
элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны
сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной
пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб
геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в каме-
ру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков
из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной.

Недавно появилось сообщение об еще одной попытке преодо-
леть указанные трудности. Препаративное фракционирование
белков вели в кольцевом 2,3%-ном ПААГ с ДДС-Na. Диализную
мембрану, отделяющую камеру элюции от нижнего электродного
резервуара, заменили слоем 10%-ного ПААГ. Во избежание
сползания рабочего геля в камеру элюирующий буфер в нее по-
давался под гидростатическим давлением, уравновешивающим
вес геля, а скорость элюции задавалась перистальтическим на-
сосом, стоящим на выходе из камеры. Сама камера имела форму
незамкнутого кольца. Элюирующий буфер подавался с одного
ее конца и выходил с другого. Сообщается о хорошем разделе-

 

нии ряда белковс молекулярными массами 100—500 тыс. при за-
грузке в гель 4 мг белка [Hardman, Kane, 1980].

Из-за его оригинальности стоит упомянуть об одном решении
проблемы камеры элюции [Marceau et al., 1975]. ПААГ полиме-
ризуют в цилиндре из плексигласа, закрытом внизу диализной
мембраной, лежащей на пористой подложке. Над самой мембра-
ной в цилиндр открываются отверстия двух трубочек. Одна из
них используется для подкачки, вторая — для слива элюирую-
щего буфера. ПААГ не прилипает к плексигласу, и весь столб
геля может перемещаться вверх внутри цилиндра. Такое пере-
мещение на очень малое расстояние вызывается кратковремен-
ной подкачкой буфера под гель при закрытом сливе. Так созда-
ется камера элюции: она существует только то время, которое
необходимо для выхода в нее очередной полосы белка. Затем
открывают кран трубочки для слива буфера. Гель под действием
собственного веса оседает, и камера полностью опоражнивается.
Процесс повторяют либо регулярно, по заданной программе, ли-
бо при подходе к нижнему концу геля очередной окрашенной
маркером белковой полосы. Перед опорожнением камеры поляр-
ность напряжения на несколько секунд сменяют на обратную,
что помогает десорбции белков с мембраны.

Проще и надежнее вести элюцию заранее окрашенных белко-
вых полос последовательно, одну за другой, в сменные диализ-
ные мешочки [Sun, Hall, 1974]. В цитируемой работе ПААГ по-
лимеризовали тоже в цилиндре из плексигласа диаметром 3 см,
по оси которого проходила трубка для дополнительного охлаж-
дения геля циркулирующей водой. Гель высотой 21 см поддержи-
вался снизу найлоновой сеткой. Сменные диализные мешочки
легко одевались на нижний конец цилиндра с помощью поли-
этиленовых переходников. Перед снятием очередного мешочка
полярность напряжения на короткое время реверсировали. Та-
ким образом авторам удалось выделить из 6 мг исходного бел-
кового препарата три компонента, относительно мало различаю-
щиеся между собой по молекулярной массе (43, 47 и 53 тыс.
яальтон).

Возможно построить препаративную систему электрофореза
с последовательной элюцией белковых полос с нижнего края
пластины ПААГ. Фирма «Bio-Rad» предлагает для этой цели
специальные прокладки, используемые при полимеризации геля.
Конструкция прокладок позволяет подвести к нижнему краю ра-
бочего геля толщиной до 6 мм по обеим его сторонам две тру-
бочки, через которые потом и осуществляют элюцию белков.
Сначала между стеклянными пластинками формы полимеризуют
пробку из плотного ПААГ, затем, как раз на уровне трубочек и
на высоту их диаметра, заливают слой раствора сахарозы, а над
этим слоем уже полимеризуют рабочий гель. Сахарозу потом за-
мещает элюирующий буфер.

Для препаративного фракционирования белков нередко ис-
пользуют систему ступенчатого электрофореза, хотя иной раз и

 

из несколько других соображений, чем создание узкой началь-
ной полосы. Наличие дополнительного формирующего геля при
большой загрузке предохраняет от преципитации белка на гра-
нице рабочего геля, позволяет увеличить объем препарата, обес-
печивает удаление из него остатков соли до начала процесса
рабочего разделения и, наконец, снимает необходимость преэлек-
трофореза, так как основная часть персульфата успевает уйти
из рабочего геля к аноду до того, как в этот гель вступают бел-
ки. Максимальная загрузка ПААГ при препаративном фракцио-
нировании белков может достигать 5 мг на 1 см² сечения геля.

Общим недостатком любых устройств с последовательной
элюцией белков в конце пути их миграции через весь гель явля-
ется продолжительность этого процесса и, в силу этого, диффу-
зия белковых зон (особенно для белков, выходящих последни-
ми), поэтому сейчас на практике отдают предпочтение обычному
(хотя и с увеличенной загрузкой) фракционированию белков в
трубках диаметром до 1,7 см или в толстых пластинах. Фракцио-
нирование ведут с примесью окрашенных «свидетелей», как было
описано выше. Аликвоту разделяемой смеси белков окрашивают
ремазолом [Sun, Hall, 1974] или посредством данзилирования
[Tijssen, Kurstak, 1979; Schetters, McLeod, 1979]; окрашенные
полосы вырезают и белки элюируют из геля за счет диффузии
или электрофореза (см. выше).

Следует иметь в виду, что при элюции белков из геля может
выходить большое количество линейного полиакриламида, не
вошедшего в состав матрицы геля. Он не обнаруживается при
оценке чистоты белка аналитическим электрофорезом. Между
тем аналитическое ультрацентрифугирование показывает, что
количество элюированного полиакриламида может быть таким
же, как и самого белка. Дополнительную очистку белка в этом
случае можно провести его сорбцией на ионообменную смолу
[Brooks, Sander, 1980].

Недавно был предложен оригинальный способ электрофоре-
тической элюции белков одновременно из нескольких полос ге-
ля, вырезанных из пластины после препаративного электрофоре-
за [Judd, 1979]. На прямоугольный поднос наносят ровный слой
.пропитанного буфером сефадекса Г-25 «суперфайн» толщиной
2—3 мм. С интервалом в 1—1,5 см перпендикулярно длинной
стороне подноса в сефадексе выскребают канавки, куда укла-
дывают полоски геля (рис. 30). По концам подноса на сефадекс
через смоченную буфером фильтровальную бумагу кладут уголь-
ные электроды и подают напряжение. Под действием электриче-
ского поля белки из каждой полоски геля мигрируют в прилежа-
щий слой сефадекса. Эти слои затем снимают, переносят в мик-
роколонки и белки из них элюируют.

Кстати, можно просто заполнить сефадексом вертикальную
колонку и использовать его в качестве антиконвекционной среды
для препаративного электрофореза белков. Это, конечно, уже не
электрофорез в геле, и качество фракционирования будет заве-

 

домо хуже, но для грубого разделения смеси белков оно может
быть вполне приемлемым.

Отметим также успешное фракционирование до 1 г белковой
смеси электрофорезом в градиенте концентрации раствора саха-
розы (10—45%) в буфере с рН 8,5. Электрофорез вели в цилиндре
диаметром 12 см и высотой 17 см [Walters, Bont, 1979]. Тонкость
метода — в наслаивании препарата на раствор сахарозы с по-
мощью металлического сита, которое поднимается по мере уве-
личения объема препарата, оставаясь сцепленным с мениском
жидкости силами поверхностного натяжения. Это позволяет на-

Рис. 30. Схема электрофоретиче-
ской элюции белков из геля в се-
фадекс [Judd, 1979]

1 —полоски, вырезанные из геля; 2—
сефадекс Г-25 «суперфайн»; 3 — уголь-
ные электроды; 4 — смоченная буфе-
ром фильтровальная бумага

 

нести 30 мл исходного белкового препарата совершенно ровным
слоем толщиной 3 мм. Электрофорез во избежание разогрева
жидкости ведут при малой плотности тока (0,2 мА/см²) в тече-
ние 15 ч. Фракции собирают, сливая содержимое колонки через
воронку, расположенную в ее нижней части. Препаративный
электрофорез в 5—25%-ном градиенте сахарозы в 0,1 М Трис-
боратном буфере (рН 8) с 6 М мочевиной был недавно исполь-
зован для очистки фотохимически сшитого комплекса тРНК и
тРНК-синтетазы [Renaud et al., 1979].

К электрофорезу в геле эти методы, разумеется, прямого от-
ношения не имеют, так как являются примерами электрофореза
в свободной жидкости. Именно с этого начиналось применение
электрофореза для фракционирования биополимеров. Однако за
последнее десятилетие, во всяком случае для аналитических це-
лей, электрофорез в свободной жидкости был полностью вытеснен
электрофорезом в гелях или на твердых носителях (бумаге, раз-
личных производных целлюлозы, полиамидных пленках и т. д.),
который широко применялся при фракционировании пептидов,
аминокислот и других сравнительно низкомолекулярных биоло-
гически важных молекул, в том числе и в высоковольтных ва-
риантах. В свое время, например, очень важную роль сыграл
метод фракционирования олигонуклеотидов гидролизата РНК
двумерным электрофорезом. В первом направлении разделение
вели на полосках ацетатцеллюлозы в пиридин-ацетатном буфе-
ре (рН 3,5) с добавлением 7 М мочевины, во втором — на ДЭАЭ-
бумаге в 7%-ной НСООН [Brownlee, 1972]. Ввиду малой емко-
сти ацетатцеллюлозы общая загрузка не превышала 0,1 мг гид-
ролизата РНК, поэтому использовали препараты, меченные ра-
диоактивным фосфором.

 

Сейчас методы фракционирования низкомолекулярных био-
логических объектов электрофорезом на твердых носителях на-
столько энергично и успешно вытесняет жидкостная хроматогра-
фия под высоким давлением (ЖХВД), что рассматривать их
уже не имеет смысла. Впрочем, изредка электрофорез на твер-
дом носителе еще используют и для фракционирования белков.
Так, сравнительно недавно было описано очень хорошее разде-
ление девяти модификаций казеина молока электрофорезом на
полосках ацетатцеллюлозы. Эти модификации различались уров-
нем фосфорилирования белка, и разделение шло по величине
электрического заряда [West, Towers, 1976].

ОГЛАВЛЕНИЕ

Часть первая
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Введение.................. 3

Глава 1

Гели для электрофореза.................. 7

Полиакриламидный гель (ПААГ)................ 7

Исходные материалы................... 7

Процесс полимеризации ПААГ............... 10

Выбор концентраций мономеров.............. 13

Агароза......................... 16

Смешанный гель (агароза+ПААГ).............. 20

Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная ПААГ....... 21

Глава 2

Техника приготовления гелей и аппаратура........... 21

Вертикально расположенные трубки....-..........: 21

Вертикально расположенные пластины.............. 26

Горизонтально расположенные пластины............ 32

Глава 3

Электрофорез белков.................... 37

Замечания общего характера.................. 37

Миграция белков в геле................. 37

Напряженность электрического поля (H)......... 38

Выбор буфера рабочего геля............... 40

Выделение тепла при электрофорезе............ 42

Загрузка геля. Ширина белковых зон............ 44

Введение мочевины и (З-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты. 46

Лидирующие красители................. 47

Разделение белков по размерам и заряду............ 48

Выбор рабочего буфера................. 48

Использование мочевины................. 50

Загрузка геля и подготовка препарата..;......... 52

Некоторые примеры................... 53

Разделение белков по размеру с использованием ДДС-Na ..... 56

Существо метода..................... 56

Выбор пористости геля.................. 59

Присутствие мочевины и нейояных детергентов........60

Выбор рабочего буфера геля...............61

Подготовка белкового препарата.............. 6в

Проведение электрофореза.........;...... 63

Окрашивание и элюция белков.............. 64

Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis)......... 66

Градиент пористости ПААГ.................. 73

Двумерный электрофорез в ПААГ................ 76

Электрофорез с использованием Тритона Х-100 в цетавлона.... 83

Тритон Х-100..................... S3

Цетавлон................. 85

Окрашивание белков в ПААГ................ 88

Кислые красители................... 90

Другие красители и методы окрашивания.......... 94

Флюоресцентные красители................ 97

Локализация ферментов после электрофореза......... 101

Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na....... 104

Элюция белков из геля............. 105

Определение радиоактивности белков после электрофореза в ПААГ. 109

Счет радиоактивности в элюатах белка........... 109

Растворение ПААГ .................... 110

Импрегнирование сцинтиллятора в гель ........... 111

Авторадиография .................... 112

Флюорография ..................... 113

Препаративный электрофорез белков .............. 116

Глава 4

Электрофорез нуклеиновых кислот ………………………………………………………... 120

Замечания общего характера………………………………………………………………….. 120

Выбор буфера геля и напряженности электрического поля……………………………..120

Выбор характера геля и его пористости…………………………………………………. 121

Влияние вторичной структуры…………………………………………………………… 123

Маркерные молекулы……………………………………………………………………...125

Лидирующие красители…………………………………………………………………… 126

Электрофорез в мягких условиях……………………………………………………………... 126

Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК…………………………………………126

Фракционирование РНК…………………………………………………………………... 128

Электрофорез в денатурирующих гелях………………………………………………………128

Щелочные гели……………………………………………………………………………..129

Гели, содержащие мочевину.Секвенирование ДНК и РНК……………………………..131

Денатурирующие гели с формамидом……………………………………………………135

Денатурирующие гели с формальдегидом……………………………………………….138

Гели, содержащие гидроокись метилртути………………………………………………140

Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем…………………………………………..142

Использование градиентов пористости ПААГ……………………………………………….142

Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов………………………….. 144

Некоторые особые случаи электрофореза нуклеиновых кислот……………………………. 147

Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК—РНК-поли-

мераза—РНК………………………………………………………………………………...147

Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы 148
Использование жидкого (не сшитого) ПААГ……………………………………………….149

Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза...... 150

Элюция нуклеиновых кислот из гелей............. 153

Элюция из ПААГ за счет диффузии............ 153

Элюция из гелей агарозы................ 154

Электрофоретическая элюция............... 158

Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры

и диазобумагу..................... 162

Определение радиоактивности................ 165

Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот........ 166

Литература....................... 168

Часть вторая
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

Введение......................... 174

Глава 1.
Основные понятия теории седиментации............ 175

Глава 2
Ультрацентрифуга..................... 177

Принцип действия и расположение важнейших узлов....... 177

Проверка готовности основных систем к пуску.......... 179

Пуск центрифуги .................... 180

Глава 3
Роторы и пробирки.................... 182

Угловые роторы....................... 182

Пробирки для угловых роторов.............. 184

Уход за роторами и пробирками .............. 187

Роторы со свободно подвешенными пробирками (бакет-роторы)... 189
Роторы с вертикальными пробирками..........'... 191

Максимально допустимая частота вращения ротора........ 191

Зональные роторы..................... 193

Особенности эксплуатации и ухода...'.......... 197

Глава 4
Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199

Глава 5

Зонально-скоростное центрифугирование............. 201

Константа седиментации .................. 203

Изокинетический градиент плотности............... 204

Выбор среды ............ ь.......... 206

Характеристики растворов сахарозы............... 210

Профиль градиента сахарозы ................. 213

Создание градиента плотности сахарозы............ 214

Наслоение препарата на градиент........ i.... 219