Другие красители и методы окрашивания

Определенные затруднения возникают при окраске кислых
фосфопротеидов, например фосфитина. Наличие отрицательно
заряженных остатков фосфорной кислоты мешает окрашиванию
анионными красителями. Конечно, можно использовать такие
положительно заряженные (катионные) красители, как толуи-
диновый синий или акридиновый оранжевый (см. ниже), но они
дают высокий уровень фона, так как матрица ПААГ всегда не-
сет на себе некоторое количество отрицательно заряженных ос-
татков акриловой кислоты.

Есть возможность пойти другим путем. Известна высокая
степень сродства фосфопротеидов к трехвалентным металлам,
поэтому можно использовать ионы А1³⁺ для блокирования заря-
дов фосфатов. Это позволит успешно вести окрашивание белков
кислым красителем. Так, для фосфопротеидов была рекомендо-
вана следующая смесь: 0,05% СВВ R-250+0,1 M A1(NO₃)₃+10%
уксусной кислоты + 25% изопропанола + 1% Тритона Х-100. От-
мывают гель, как обычно, в 7%-ной уксусной кислоте [Hege-.
nauer et al., 1977].

Гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты
можно окрасить одновременно красителем с выразительным
фирменным названием «Stains-all», формула которого представ-
лена ниже.

0,1%-ный маточный раствор этого красителя в формамиде
можно хранить при 4° в темной бутыли в течение месяца. Его ра-
бочая концентрация—0,0012% в 0,01 М Трис-НСl (рН 8,5) с
5% формамида и 25% изопропанола. Окрашивать гель следует
в темноте, в течение ночи. Можно затем отмывать гель в воде, но
делать это не обязательно, так как на свету находящийся в геле
свободный краситель быстро выцветает, в то время как связан-
ный с белком оказывается значительно более стойким. Замеча-
тельно, что разные по своей природе биополимеры окрашивают-
ся при этом в различные цвета: гликопротеиды—в синий, бел-
ки — в красный, липиды — в желто-оранжевый, ДНК — в синий,
а РНК — в голубовато-пурпурный. Однако по чувствительности
этот универсальный краситель заметно уступает специализиро-
ванным. Кроме того, он обесцвечивается при контакте с ДДС-Na,

 

который из-за этого приходится отмывать после электрофореза,
вымачивая гель в течение 18—36 ч в 25%-ном растворе изопро-
панола [King, Morrison, 1976].

Если примириться с некоторой диффузией полос во время ок-
рашивания и не осаждать белки, то их можно красить в водных
буферах кислыми или щелочными красителями (в зависимости
от заряда белка). Связь между красителем и белком в этих слу-
чаях осуществляется в основном за счет сил кулоновского взаи-
модействия. В области нейтральных рН такие кислые красители,
как СВВ, бромфеноловый синий и «Fast green», заряжены отри-
цательно. Их изоэлектрическая точка лежит ниже рН 3,5. Ще-
лочные красители (метиленовый синий, толуидиновый синий и
пиронин) в нейтральных буферах несут положительный заряд
(р I >9,5). Таким образом, кислые белки в мягких условиях мож-
но красить щелочными красителями, а щелочные—кислыми.
Красители растворяют в воде до концентрации 0,02% и нейтра-
лизуют раствор добавлением 0,2 М фосфатного буфера (рН 7)
до концентрации 5 мМ. Гель после электрофореза для удаления
избытка рабочего буфера вымачивают в воде в течение 5 мин,
затем окрашивают 10 мин при комнатной температуре. Отмыть
фон можно в течение часа в деионизованной воде или смеси ме-
танол—вода (1: 2), что стабилизирует окраску. Окрашенные ге-
ли хранят в разбавленных водных растворах красителей во избе-
жание их десорбции. В воду добавляют в качестве антисептика
азид натрия до концентрации 0,01% [Ruchel et al., 1978].

Недавно был предложен принципиально новый способ окрас-
ки белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по
утверждению авторов, на два порядка более высокую чувстви-
тельность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окраши-
вают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов
меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, рас-
творенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель пред-
варительно обрабатывают формальдегидом. После первой обра-
ботки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно кон-
центрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и,
наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формаль-
дегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окра-
шивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением се-
ребра в фотографическом процессе, так как «передержанный»
гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии.

Несмотря на свою огромную чувствительность, предложен-
ный способ достаточно сложен и связан с расходом дорогостоя-
щего нитрата серебра, поэтому в середине 1980 г. другая группа
авторов опубликовала упрощенную методику высокочувстви-
тельной окраски белков серебром, дающую, по-видимому, такие
же результаты [Oakley et al., 1980]. Ввиду перспективности это-
го метода цитируем его подробно.

95

Все растворы готовят на бидистилляте, а работу ведут в перчатках. При-
веденный ниже режим обработки соответствует пластинам размером 140x
x140x0.8 мм; для более толстых гелей продолжительность обработки на
каждом этапе надо увеличить. При всех процедурах, кроме одной, используют
осторожное перемешивание растворов на ротационной мешалке («New Bruns-
wick gyrotory shaker», модель 2) со скоростью 40 об/мин. Ниже описаны со-
ответствующие процедуры.

Гель вымачивают в течение 30 мин в 10%-ном водном растворе глутаро-
вого альдегида, споласкивают в течение 10 мин в 0,5—1 л воды с двумя сме-
нами и оставляют для набухания в воде не менее чем на 2 ч. Затем воду сли-
вают и заливают гель свежеприготовленным раствором аммиачного серебра.
Для получения 100 мл этого раствора добавляют 1,4 мл свежего концентри-
рованного раствора аммиака к 21 мл 0,36%-ного раствора NaOH, а затем с
энергичным перемешиванием медленно прибавляют 4 мл 19,4%-ного раствора
азотнокислого серебра (20 г AgNO₃+100 мл воды). При этом может времен-
но образоваться коричневый осадок. После его растворения добавляют воду
до объема 100 мл. Для создания хорошей, ровной окраски и во избежание
прилипания геля ко дну надо, чтобы он свободно плавал в ванночке размером
20Х20 см со 150 мл раствора аммиачного серебра. Скорость перемешивания
в это время следует увеличить до 75 об/мии. Окрашивание должно длиться не
более 15 мин, чтобы серебро не успело осесть на поверхности геля. Так как
раствор аммиачного серебра при высыхании может взрываться, после его ис-
пользования серебро осаждают в виде AgCl подкислением НС1. Гель вынима-
ют из раствора и промывают водой в течение 2 мин. Чтобы он не прилип к
кювете, здесь и на следующем этапе следует не сливать жидкость, а перено-
сить его из кюветы в кювету. Затем гель переносят в свежеприготовленный
раствор, содержащий 0,005% лимонной кислоты и 0,019% формальдегида.
(разбавлен из продажного 3'8%-ного формальдегида в 10%-ном метаноле); при этом и проступают полосы белков. Гель вынимают, когда фон только на-
чинает темнеть, и промывают водой в течение часа с тремя сменами при пере-
мешивании. Если концентрация ПААГ превышает 10%, то фон может ока-
заться темным. Он уменьшается в случае предварительной фиксации белков в
10%-ной уксусной кислоте с 50% метанола в течение 30 мин и последующей
промывки геля в 7%-ной уксусной кислоте с 5% метанола в течение ночи.

Минимальная концентрация белка в полосе, которую можно
обнаружить, составляет примерно 10^-4 мкг/мм². По приведенным
в работе фотографиям создается впечатление, что чувствитель-
ность метода столь же высока, как и первоначальной методики
Меррила и соавторов, но четкость линий немного хуже. В этом
случае также возможно ослабление с помощью фотоослабите-
лей.

Хотя в рассмотренной работе об этом и не говорится, Меррил
и соавторы указывают, что после окрашивания серебром гели
становятся хрупкими. Для высушивания их рекомендуется пред-
варительно подвергнуть следующей обработке: вымочить в тече-
ние 15 мин в 30%-ном водном растворе тиосульфата натрия, про-
мыть 4 раза по 15 мин в воде и, наконец, вымочить в смеси ме-
танол — вода — глицерин (70: 27: 3) в течение 5 мин.

 

В начале 1981 г. Меррил и соавторы предложили еще одну
методику окрашивания белков в геле серебром. В отличие от их
первого метода, где был использован гистологический подход, в
данном случае восстановление серебра происходит фотохимиче-
ским путем.

После двумерного разделения белков в ПААГ по 0'Фарреллу их фиксиру-
ют и одновременно вымывают ДДС-Na сначала раствором, содержащим 12%
СН₃СООН и 50% метанола (10 мин), потом дважды по 5 мин—5%-ной
СН₃СООН с 10% этанола. Далее для улучшения равномерности окраски гель
вымачивают 5 мин в 0,5%-ном растворе железосинеродистого калия (красной
кровяной соли). После трехкратного ополаскивания в воде гель заливают рас-
твором, содержащим 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл
37%-ного формальдегида и 0,06 мг бензотриазола (антивуалирующего сред-
ства для фотографии) в 100 мл воды. Гель в растворе освещают вольфраме-.
вой лампой накаливания мощностью 1500 Вт в течение 20 мин. Затем раствор
сливают и гель, не споласкивая, заливают 200 мл 3%-ного раствора Na₂CO₃,
содержащего 0,1 мл формальдегида и 0,12 мг бензотриазола. Окраска появ-.
ляется уже через 1 мин. Не прекращая освещения, раствор сменяют 2—3 раза
до достижения желаемой интенсивности окраски белков. Процесс окрашива-
ния прерывают погружением геля на 5 мин в 1%-ный раствор СН₃СООН,
а затем промывают его водой.

Чувствительность метода столь же высока, как и у ранее опи-
санных методов окраски серебром, но процедура существенно
проще, дешевле и занимает всего 1 ч [Merril et al., 1981].

Флюоресцентные красители

Данзилхлорид выпускается в виде двух кристаллических
форм: кристаллы красного цвета плавятся при 70°, желтые—-
при 73°. Они хорошо растворяются в ацетоне. Максимум их пог-
лощения в растворе лежит в области 330—360 нм, флюоресцен-
ции — 510 нм. Молярная экстинкция E =4,3 · 10⁶.

В щелочной среде, отщепляя ион хлора, данзильный остаток
присоединяется к аминокислотам, пептидам и белкам, главным
образом, по их концевой аминогруппе. При этом его способность
флюоресцировать сохраняется.

 

Данзилирование белков и пептидов позволяет следить эа хо-
дом их миграции при электрофорезе путем освещения гелей
длинноволновым ультрафиолетовым светом, достаточно хорошо
проникающим через пирексовое стекло. Скорость миграции бел-
ков при данзилировании практически не изменяется, поэтому не-
большие примеси данзилированных препаратов можно исполь-
зовать в качестве маркеров при разделении неокрашенных бел-
ковых смесей.

Данзилирование не мешает протеолизу белка, что позволяет

проводить пептидный анализ данзилированных белков после их
разделения электрофорезом в ПААГ и элюции из геля. При этом
удается обнаруживать по флюоресценции не только концевые,
но и внутренние пептиды. Дело в том, что Данзилирование, хотя
и намного менее эффективно, чем по концевым аминогруппам,
происходит (в порядке ослабления) по SH- и ОН-группам цис-
теина и тирозина, e-NН₃-группам лизина и по гистидину. Цен-
ным является то обстоятельство, что автолиз неданзилирован-
ных протеаз не создает никаких помех при картировании пепти-
дов.

Недавно описано Данзилирование белков для последующего
разделения ступенчатым электрофорезом в комплексе с ДДС-Na
(в системе Лэммли) [Tijssen, Kurstak, 1979]. Белки растворяют
до концентрации 2 мг/мл в 0,1 М Трис-ацетатном буфере (рН
8,2) с 10% ДДС-Na, добавляют 1/15 объема 10%-ного. раствора
данзилхлорида в ацетоне и, закрыв пробирку парафильмом, ин-
кубируют в течение 15 мин на водяной бане при 50°. Свободный
данзилхлорид нерастворим в водном ацетоне и образует мутно-
желтую суспензию, тем не менее Данзилирование в ней происхо-
дит. Раствор просветляется после добавления 1/15 объема (b-мер-
каптоэтанола и дополнительной инкубации в течение 15 мин.
Меркаптоэтанол связывает и растворяет избыток данзилхло-
рида.

Инкубационную смесь можно без дальнейшей очистки под-
вергать электрофорезу. Ярко люминесцирующие побочные про-
дукты данзилирования быстро отделяются от белков и уходят
вперед. В работе описан и препаративный вариант разделения
белков под контролем данзилированных аликвот. При этом ис-
пользуется электрофоретическая элюция белковых полос из ге-
ля. Описан также пептидный анализ разделенных белков элек-
трофорезом в системе Лэммли с градиентом пористости рабоче-
го геля. Несколько ранее препаративный электрофорез белков
под контролем данзилированных аликвот был описан Стефенсом
[Stephens, 1975].

Флюоресцамин (иногда поставляется под фирменным наиме-
нованием «Fluram») — желтовато-белый порошок, хорошо раст-
воримый в ацетоне, диметильсульфоксиде и ацетонитриле. Хра-
нить раствор следует не более двух недель: он неустойчив, осо-
бенно при рН<4 и рН>10. При взаимодействии с первичными
аминами (концевыми аминогруппами, e-NH₂-группами лизина)

 

в водной среде флюоресцамин дает сильно флюоресцирующие
продукты в соответствии с представленной ниже схемой.

Реакция идет успешнее в щелочной среде. Продукт реакции
имеет два максимума поглощения (при 300 и 390 нм) и макси-
мум флюоресценции при 480 нм. Замечательно, что ни сам флюо-
ресцамин, ни продукты его распада в растворе не флюоресци-
руют. При окрашивании белков и пептидов флюоресцамином не
создается флюоресцирующего фона и окрашенный продукт мож-
но не отделять от красителя, что чрезвычайно удобно. При ис-
пользовании флюоресцамина для окраски белков или пептидов
перед электрофорезом следует иметь в виду, что он вносит до-
полнительный отрицательный заряд (за счет образующегося
карбоксила) и этим изменяет электрофоретическую подвижность
окрашенного белка. В случае разделения белков, обработанных
ДДС-Na, этот единичный заряд практической роли не играет.

В недавней работе [Jackowski, Liew, 1980] флюоресцамин использовали
для окраски белков после их двумерного фракционирования влектрофокуси-
ровкой и электрофорезом по методу 0'Фаррела. Белки фиксировали в пласти-
не геля, вымачивая ее в течение ночи в 10%-ной уксусной кислоте с 50% ме-
танола (одновременно вымывались амфолины, которые окрашиваются флюо-
ресцамином). Гель споласкивали в 7%-ной уксусной кислоте, помещали на
1 ч в диметилсульфоксид (ДМСО) и на 2ч — в 0,04 М раствор борной кисло-
ты в ДМСО, титрованный NaOH до рН 10. Затем добавляли равный объем
раствора флюоресцамина (0,5 мг/мл) в ДМСО и встряхивали смесь в течение
8 ч. Белковые пятна проявлялись уже через 2 ч. Их фотографировали при ос-
вещении длинноволновым ультрафиолетовым светом.

Хранить гель в ДМСО следует в темноте: на свету способ-
ность к флюоресценции за 24 ч падает до нуля. Чувствитель-
ность и разрешающая способность окраски флюоресцамином
примерно такие же, как и СВВ R-250, но линейный участок за-
висимости интенсивности окраски (флюоресценции) от количе-
ства белка больше — вплоть до 7 мкг белка на 1 см² в пятне или полосе. Для окраски СВВ R-250 линейность сохраняется не да-
лее, чем для 3 мг/см².

Окрашивание белка флюоресцамином перед электрофорезом
было использовано значительно раньше [Eng, Parkers, 1974].
Белок, обработанный ДДС-Na, растворяли до концентрации

 

0,5—1 мг/мл в 0,017 М Na-фосфатном буфере (рН 8,5) с 5%
ДДС-Na. К 100 мкл этого раствора добавляли 5 мкл раствора
флюоресцамина в ацетоне и встряхивали. Затем без дальнейшей
очистки 10 мкл этой смеси вносили в трубку для электрофореза.
Замечено, что ДДС-Na уменьшает эффективность окраски
флюоресцамином. По-видимому, он создает препятствия для
контакта красителя с аминогруппами белка. Аналогично исполь-
зовали флюоресцамин и для окраски пептидов перед электрофо-
резом [Rosemblatt et al., 1975]. В 1976 г. было описано исполь-
зование для окрашивания белков перед электрофорезом родст-
венного флюоресцамину препарата МДФФ (2-метокси-2,2-ди-
фенил-3-фуранона) [Barger et al., 1976]. Как и флюоресцамин,
этот препарат реагирует с первичными аминами, давая сильно
флюоресцирующие продукты, в то время как сам он в растворе
не флюоресцирует. Схема реакции представлена ниже.

В отличие от флюоресцамина МДФФ не привносит с собой
дополнительного заряда. Он хорошо растворим в ацетоне и
абсолютном метаноле. Максимум возбуждения флюоресцирую-
щего продукта — при 390 нм, флюоресценции — при 745 нм.
Реакция идет лучше в щелочной среде (рН 9,5.) Продукт устой-
чив в интервале рН 2—10. Интенсивность флюоресценции—в
2,5 раза выше, чем при окраске флюоресцамином. Она лишь не-
значительно уменьшается в случае предварительной обработки
белка ДДС-Na и b-меркаптоэтанолом при 100°. Чувствитель-
ность метода очень высока: по утверждению авторов, им удава-
лось обнаруживать до 0,001 мкг белка в полосе. В отличиеот
флюоресцамина окраска не ослабевает в течение нескольких ме-
сяцев. Однако есть данные, что с длинными полипептидными
цепями МДФФ реагирует слабее, чем флюоресцамин. Окраши-
вание ведут в 0,01 М боратном буфере (рН 9,5), энергично пере-
мешивая раствор белка с избытком раствора МДФФ в ДМСО.

Недавно [Chen, Thomas, 1980] МДФФ был использован для
окраски бромциановых пептидов альдолазы перед их разделе-
нием электрофорезом в 15%-ном ПААГ с ДДС-Na. Пептиды,
обработанные ДДС-Na и р-меркаптоэтанолом, окрашивали в
0,1 М Li-боратном буфере (рН 9,5), добавляя к ним в пятикрат-
ном избытке МДФФ, растворенный в абсолютном метаноле.

 

Ортофталевый альдегид (ОФА) в присутствии b-меркапто-
этанола реагирует с первичными аминами белков и пептидов,
давая сильно флюоресцирующий продукт в соответствии с при-
веденной ниже схемой.

ОФА растворим в воде, но лучше—в метаноле, этаноле, аце-
тоне и диоксане. Реакция присоединения хорошо идет при
рН 8—9. При использовании ОФА его сначала растворяют в
одном из перечисленных органических растворителей, а потом
смешивают с избытком водного буфера нужной концентрации и
значения рН. Максимум возбуждения флюоресцирующего про-
дукта — при 340 нм, флюоресценции — при 445 нм. Раствор са-
мого ОФА не флюоресцирует. Чувствительность метода — выше,
чем в случае флюоресцамина, но и фон флюоресценции побочных
продуктов выражен сильнее.

Использование ОФА для окрашивания комплексов белок—
ДДС-Na перед их электрофорезом описано еще в 1973 г. [Wei-
dekamm et al., 1973]. Реакцию проводили в 0,025 М Na-фосфат-
ном буфере (рН 8,5) в присутствии 5% ДДС-Na и 2% b-меркап-
тоэтанола. Сначала белок растворяли в этой смеси и прогревали
при 100° для полной денатурации и восстановления, затем туда
добавляли 1/5 объема 1%-ного раствора ОФА в метаноле и вы-
держивали в темноте 2—3 ч.