Вертикально расположенные трубки

Вертикальное расположение трубок и пластин имеет то пре-
имущество, что препарат, наносимый на гель сверху, при любом
его объеме равномерно покрывает всю рабочую поверхность ге-
ля. Затруднения при вертикальном расположении могут возни-

 

Рис. 5. Прибор для электрофореза
в вертикальных трубках (в разре-
зе)

1  — верхний электродный резервуар;
2 — центральный цилиндр; 3 — верхний
платиновый электрод; 4 — резиновая
прокладка; 5 — трубочка с гелем; 6 —
нижний электродный резервуар; 7  —
нижний платиновый электрод

кать для гелей, недостаточно прочно сцепленных со стеклом (см.
выше). Под действием собственного веса они могут постепенно
сползать вниз. Реальные трудности такого рода возникают,
главным образом, в случае препаративного электрофореза, ког-
да соотношение поверхности и объема колонок геля способству-
ет его сползанию.

Все приборы с вертикальным расположением гелей конструк-
тивно сложнее, чем аппараты с горизонтальным расположени-
ем, так как верхний электродный резервуар должен быть под-
нят над гелем. Приходится заботиться об уплотнениях в местах
сочленения его с трубками или пластинами. В приборах с труб-
ками для уплотнения обычно служат резиновые кольцевые про-
кладки, укрепленные в отверстиях на дне верхнего резервуара.
Схема такого прибора показана на рис. 5.

Трубки (12 — 18 штук) с уже заполимеризованным в них ге-
лем вставляют снизу в резиновые прокладки так, чтобы их верх-
ние концы выступали над дном резервуара. Если используют не
все трубки, то на их место ставят заглушки. Собранный вместе
с трубками верхний электродный резервуар устанавливают на
нижний так, чтобы концы трубок оказались на некотором рас-
стоянии от дна последнего и заполняют нижний резервуар элек-
тродным буфером, нередко до такого уровня, что трубки оказы-
ваются почти полностью погруженными в буфер. Это делается
для улучшения теплоотвода в процессе электрофореза С этой
же целью нижний буфер перемешивают магнитной мешалкой
или вводят дополнительную систему с циркуляцией охлаждаю-
щей воды. Оба резервуара цилиндрической или прямоугольной
формы изготавливают из плексигласа, что позволяет следить за
продвижением фронта красителя в процессе электрофореза.
В резервуарах должны быть закреплены электроды из платино-
вой проволоки. Нижний электрод при этом должен располагать-

 

ся так, чтобы поднимающиеся от него пузырьки газа не попада-
ли на нижние торцы трубок, что создавало бы помехи протека-
нию через них тока. Объемы электродных резервуаров доста-
точно велики, чтобы рН находящегося в них буфера не изменял-
ся под влиянием продуктов электролиза.

Стеклянные тонкостенные трубки, в которых ведут электро-
форез, чаще всего имеют внутренний диаметр 5 — 6 мм и длину
около 10 см. Фирма «Bio-Rad» в своем приборе модели 155 пред-
лагает широкий набор трубок с внутренним диаметром от 2 до
14,6 мм и длиной от 7,5 до 30 см. Их можно монтировать в пяти
сменных верхних резервуарах. Торцы трубок отшлифованы. При
изготовлении трубок в лаборатории не следует оплавлять их в
пламени горелки во избежание образования незаметного на
глаз сужения, которое будет мешать извлечению геля после
окончания электрофореза.

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок за-
клеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают
их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор моно-
меров сразу после добавления и надежного смешивания с ним
раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из
пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний
участок трубки, предназначенный для внесения препарата, ос-
тавался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или
изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем
разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза
(см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабо-
чего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером
верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой
раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него
воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем
в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают
верхним электродным буфером.

Собрав прибор, заливают буфер в верхний электродный ре-
зервуар. При полимеризации геля часть трубки с верхнего ее
конца оставляют свободной, и туда при заливке попадает элек-
тродный буфер. Затем под него, на поверхность геля, пипеткой
с оттянутым полиэтиленовым наконечником наслаивают препа-
рат, в который добавляют предварительно 5 — 10% сахарозы.
Наконечник пипетки не следует подносить вплотную к поверхно-
сти геля; препарат должен выливаться с высоты 2 — 3 мм над
гелем и свободно растекаться по его поверхности за счет своей
повышенной плотности. При любом варианте электрофореза на-
до быть уверенным в том, что исходный препарат свободен от
взвешенных частиц (пыли или осадков), которые будут соби-
раться на торце геля и нарушать однородность тока по его сече-
нию, что повлечет за собой деформацию разделяющихся зон.
В этом случае препарат следует отфильтровать или очистить
центрифугированием.

 

Рис. 6. Система для обра- зования линейного градиен- та концентрации ПААГ в трубках 1  — пачка трубок; 2 —  перисталь- тический насос; 3 —  смеситель градиента

Выше уже упоминалось о возможности использования гра-
диента пористости геля с изменяющимся по его длине, т. е. по
высоте трубки, содержанием акриламида. Были также приведе-
ны соображения, касающиеся подбора концентраций иниции-
рующих добавок в этом случае. Преимущества таких «градиент-
ных» гелей будут рассмотрены ниже. Для получения градиент-
ных гелей используют такие же смесительные устройства, как
при создании градиентов плотности сахарозы для ультрацент-
рифугирования. В этом случае также можно получать линейные
и нелинейные градиенты, «выпуклые» и «вогнутые», в том чис-
ле экспоненциальные.

В смеситель можно поместить раствор мономеров с макси-
мальным содержанием акриламида, а в резервуар смесительно-
го устройства — соответственно разбавленный раствор. Затем
можно заливать закрытую снизу трубку по стенке подобно цен-
трифужной пробирке, однако это довольно неудобно ввиду ма-
лого объема трубки (2 — 4 мл). Кроме того, почти всегда жела-
тельно иметь несколько трубок с заведомо одинаковой формой
градиента, поэтому лучше заливать одновременно целую пачку
параллельно расположенных трубок. Всю пачку, скрепив ее ре-
зинками, закрепляют вертикально в стакане таким образом, что-
бы нижние торцы трубок были слегка приподняты над его дном,
Через отросток, припаянный у дна стакана (или через одну из
трубок), насосом подают градиент смеси мономеров (рис. 6)
Заполнение трубок идет снизу вверх, поэтому в смесителе гради-
ентного устройства должен находиться раствор мономеров ма-
лой концентрации, а в резервуаре — концентрированный рас-
твор. В него следует добавить до 10% сахарозы, чтобы по мере
поступления в стакан с трубками плотность жидкости заметно
увеличивалась одновременно с повышением содержания акри-
ламида. Это обеспечит равномерное оттеснение менее концент-
рированных слоев вверх по трубкам. По окончании заполнения
в каждую трубку следует наслоить одинаковое (и минимально
необходимое) количество воды или изобутанола. Еще лучше на-
чинать заполнение трубок с воды, а в раствор мономеров, нахо-
дящийся в смесителе, добавить 2% сахарозы.

 

Следует помнить о необходимости промывки смесительного
устройства и системы подачи растворов в стакан сразу после
окончания их использования, до того как в них произойдет по-
лимеризация акриламида. Разумеется, для этого всю систему
нужно отсоединить от стакана, зажав предварительно подво-
дящую к нему трубку.

По окончании полимеризации всю пачку трубок следует из-
влечь из стакана, разнять, с каждой удалить гель (снаружи) и
обрезать его излишек у нижнего конца. Возможно, хотя техни-
чески и более сложно, создание линейного градиента ПААГ за
счет перемешивания двух одинаковых по высоте слоев раствора
мономеров разной концентрации в наклонном положении [Lo-
rentz, 1976].

В описанном приборе для вертикального электрофореза элек-
трическая цепь надежно замыкается непосредственными кон-
тактами обоих концов трубок с электродными буферами. Одна-
ко надо следить за тем, чтобы на нижних торцах гелей не было
пузырьков воздуха, оставшихся там с момента погружения тру-
бок в нижний резервуар. Пузырьки можно удалить струёй жид-
кости, направленной из шприца с согнутой иглой.

По окончании электрофореза гель из трубки извлекают.
В большинстве случаев это легко сделать с помощью длинной и
затупленной иглы шприца, которую вводят с одного из концов
трубки, круговыми движениями постепенно отслаивая гель от
ее стенок. Если необходимо, такую операцию повторяют и с дру-
гого конца. Через иглу при этом поступает вода из закрепленно-
го несколько выше иглы резервуара (или от насоса). Если гель
отслаивается с трудом, в воду можно добавить 0,5 — 1% какого-
нибудь детергента. Во избежание поломки следует дать гелю
возможность выскользнуть из трубки в сосуд с водой, над кото-
рым проделывают описанную манипуляцию. Иногда для удале-
ния геля из очень длинных трубок по его периферии с концов
трубки впрыскивают глицерин, а сам гель выталкивают водой
из присоединяемого к трубке шприца. Если гель высокой кон-
центрации вынуть не удается, его приходится замораживать, а
трубку разбивать молотком. Иногда можно решить проблему
путем вымачивания трубки с гелем в метаноле: гель постепенно
съеживается и отстает от стенки.

Основным недостатком электрофореза в трубках является
затрудненный отвод тепла даже при диаметре 5 мм. На оси ге-
ля температура оказывается выше, чем у его прилегающей к
стеклу поверхности. Это приводит к изгибу зон и соответствен-
но окрашенных полос, поскольку электрофоретическая подвиж-
ность зависит от температуры. В условиях хорошего теплоотво-
да можно вести микроэлектрофорез в стеклянных капиллярах
диаметром 0,7 — 1,5 мм [Condeelis, 1977].