Счет радиоактивности в элюатах белка

Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции
белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по-
мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует
помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной,
поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля
при таком подходе носит более или менее приближенный харак-
тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением
белкового раствора.

Один из специфических вариантов счета радиоактивности
элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с
ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового
препарата. В нем используется способность комплекса белок—
ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас-
твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на
нитроцеллюлозных фильтрах типа «Millipore НА». К элюату бел-
ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в
качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра-
ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ.
Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос-
ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным
раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис-
пользование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как
в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а
на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп-
лексов белок—ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].

Для качественного определения радиоактивности ¹⁴С и ¹²⁵I
белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм)
можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из
стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на
бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин
при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно-
сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].

 

Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю-
чает диффузию нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na
из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные
10%-ным раствором NH₄OH. Диффузия идет в течение суток при
комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры
.сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег-
да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку-
лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].

Растворение ПААГ

Полноту счета радиоактивности белка можно обеспечить
растворением геля. Обычный ПААГ можно растворить при по-
вышенной температуре в 30%-ном растворе перекиси водорода.
Если белки мечены ¹⁴С, то к раствору Н₂О₂ следует добавить
NH40H,до концентрации 1%, чтобы улавливать радиоактивный
¹⁴СО₂. Проще всего кусочек геля с белком растворять именно в
такой смеси при 65° в течение 4—6 ч и далее просчитывать ра-
диоактивность в сцинтилляторе на основе диоксана. Однако
эффективность счета в диоксановом сцинтилляторе ниже, а воз-
можность артефактов — тушения и хемолюминесценции — вы-
ше, чем в толуоловом сцинтилляторе, поэтому после описанного
растворения геля в Н₂О₂ с NH₄OH иногда предпочитают исполь-
зовать один из фирменных «солюбилизаторов» и считать радио-
активность в сцинтилляторе на основе толуола [Goodman, Mat-
zura, 1971 ]. Хорошие результаты дает растворение ПААГ в
30%-ной Н₂О₂ с 5% NH40H (37°, 6 ч) в комбинации со сцинтил-
лятором на основе ксилола, выпускаемым фирмой NEN под наз-
ванием «Aquasol». Для подавления хемолюминесценции щелоч-
ного раствора в сцинтиллятор добавляют около 0,01 объема ле-
дяной уксусной кислоты.

Растворять ПААГ или хотя бы белок внутри него можно и
без перекиси водорода, с помощью некоторых фирменных солю-
билизаторов. Так, «Soluene» фирмы «Packard» растворяет ПААГ
в результате энергичного встряхивания в течение суток при 60—
65°. В солюбилизаторе NCS фирмы «Nuclear Chicago» при ана-
логичной обработке гель сильно набухает, белок растворяется и
выходит в сцинтиллятор [Paus, 1971]. Фирма NEN («New Eng-
land Nuclear») рекомендует для обработки ПААГ использовать
3%-ный раствор солюбилизатора «Protosol» в сцинтилляцион-
ной смеси под названием «Econofluor». За ночь при 37° гель на-
бухает, и около 80% белка переходит в сцинтиллятор. Наконец,
недавно был предложен специальный «коктейль», содержащий
6 г ППО, 10 мг NCS и 10 мл «Hyamine 10X hydroxide» в 1 л то-
луола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной темпера-
туре в эту смесь из ПААГ выходит до 95% белка [Aloyo, 1979].

Тщательное сопоставление всех перечисленных выше мето-
дов для счета тритиевых препаратов после электрофореза в
ПААГ было недавно проведено Муром [Moore, 1980]. Наилуч-

 

шие результаты, по данным автора, дает обработка' предвари-
тельно растертого геля в течение ночи при комнатной темпе-
ратуре 1%-ным раствором солюбилизатора «Soluene 350» в то-
луоле, содержащим 0,5% ППО и 0,05% вторичного сцинтиллято-
ра MSB фирмы «Packard». Для ускорения процесса можно
предварительно солюбилизировать кусочек геля в 0,5 мл «Solue-
ne 350» при 50° в течение 3 ч, а затем добавить 10 мл того же
толуолового сцинтиллятора. Эффективность счета трития состав-
ляет около 60%, а выход достигает 90—95%.

Полное растворение геля легко осуществить в том случае,
когда при полимеризации вместо метиленбисакриламида гель
сшивают более лабильным бифункциональным агентом. В гла-
ве 1 уже был назван в этом качестве NN^/-диaллилтapтapдиaмид
(ДАТД) и указаны условия растворения сшитого им геля в
йодной кислоте [Anderson, McClure, 1973]. В другом варианте
растворимого геля используют NN^/-(l,2-диoкcиэтилeн)-биcaкpи-
ламид (ДОЭБА), который легко синтезировать из акриламида и
глиоксаля. Гель, сшитый ДОЭБА, растворяется в 0,025 М НЮ4
при 50° в течение 48 ч. Авторы работы [O'Connel, Brady, 1976]
утверждают, что гели, сшитые ДОЭБА, отличаются более вос-
производимыми характеристиками, чем при использовании
ДАТД. Описан также растворимый ПААГ, сшитый бисакрилил-
цистамином, который готовят из цистамина и акрилилхлорида
[Hansen, 1976]. Этот гель растворяется в b-меркаптоэтаноле за
2—3 мин. В приготовлении таких гелей имеется целый ряд тон-
костей, которые необходимо учитывать во избежание образова-
ния дополнительных, устойчивых к воздействию (3-меркаптоэта-
нола сшивок [Hansen et al., 1980]. NN^/-Бисакрилилцистамин в
настоящее время выпускается фирмой, так же как ДАТД и
ДОЭБА.

Несмотря на свою кажущуюся привлекательность раствори-
мые ПААГ не получили широкого распространения — скорее
всего; ввиду худшей воспроизводимости их характеристик. Очень
легко — простым нагреванием — расплавляются гели агарозы,
но их применяют в основном для электрофореза нуклеиновых
кислот, поэтому рассмотрение этого вопроса имеет смысл отло-
жить до следующей главы.