Методы культивирования вирусов

1. Организм лабораторных животных

Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, кроликов, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально и др.) в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма ограничено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними микробами, а также по экономическим и этическим соображениям.

2. Куриные эмбрионы

Куриные эмбрионы (5-12 дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости (аллантоисная, амниотическая), желточный мешок и ткани зародыша. Таким образом, можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются возможность накопления вирусов в больших количествах, отсутствие скрытых вирусных инфекций, доступность для любой лаборатории.

3. Клеточные культуры

Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых тканей, обладающих по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению.

Типы тканевых культур

Типы клеточных культур

1. Первичные (трипсинизированные) культуры - фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных. Их получают из клеток различных тканей путем размельчения и трипсинизации. Используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2. Линии диплоидных клеток (полуперевиваемые) пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более 40-50 пассажей (теряют исходные свойства). Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, не претерпевают злокачественной трансформации, но имеют ограниченную продолжительность жизни.

3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам. Наиболее удобны в вирусологической работе - линии опухолевых клеток Hela (рак шейки матки), Hep (рак гортани).

Методы индикации вирусов

Индикация вирусов – обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками.

Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов: ЦПД вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции гемагглютинации, гемадсорбции, «цветной» реакции (табл.37).

Таблица 37. Методы индикации вирусов

ЦПД -видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов	Культура клеток ЦПД вируса
Включения -скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения – тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы - внутриядерные включения.
Бляшки, или “негативные” колонии - ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации (качественно-количественный).
РГА основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов – гемагглютининов.
Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты за счет включения в их оболочку гемагглютинина вируса.
“Цветная” реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный цвет.

Занятие № 2