Работа 8. Влияние рН среды на активность амилазы

Цель: изучить влияние рН среды на активность амилазы

Объекты, реактивы, оборудование: вытяжка амилазы изпроросших семян ячменя, 0,1н растворы НСl и NaОН, 0,2% крахмальный клейстер, разбавленный раствор йода; пробирки, пипетки на 2 и 5 мл с делениями и без делений, водяная баня, штативы и держатели для пробирок.

Краткие сведения

Активность ферментов зависит от рН среды. Эта зависимость выражается кривой с максимумом, положение которого у разных ферментов существенно различается. Так, оптимум активности кислой фосфатазы лежит в пределах рН 3,0–4,0, хлорофиллазы при рН 5,9, лиазы и рибонуклеазы при рН 8,0. При значениях рН ниже или выше оптимума активность фермента падает. Это объясняется тем, что изменение соотношения концентрации ионов Н⁺ и ОН^– (по сравнению с оптимальным) вызывает нарушение структуры белковой части фермента и, что особенно важно, его активного центра. Это приводит к частичной или полной инактивации фермента. Если же ионизирован и субстрат, то действие выражено еще сильнее.

Опыт по выяснению влияния рН на активность фермента заключается в том, что в реакционную среду, состоящую из субстрата и вытяжки фермента, вводится необходимое количество кислоты или щелочи для создания определенного рН. Можно пользоваться вытяжками фермента в буферных средах с разным значением рН. Через установленное время определяют активность фермента по характеру образующихся продуктов гидролиза.

Ход работы

Приготовить вытяжку амилазы из проросших зерен ячменя (аналогично предыдущей работе). Растереть в фарфоровой ступке примерно 5 г семян ячменя с небольшим количеством кварцевого песка. Насыпать в пробирку (на 1,5 см), залить 10 мл теплой воды (35–40⁰С), смешать с 1–2 каплями глицерина, встряхнуть содержимое и настоять 30 мин. По истечении указанного времени вытяжку профильтровать через увлажненный складчатый фильтр в чистую пробирку.

В штатив поставить в два ряда по 4 пробирки.

В 4 пробирки 1-го ряда налить по 4 мл 0,2% крахмального клейстера и создать необходимое значение рН в каждой, добавляя в первую ^__ 1 мл 0,1н НСl (рН 3), во вторую ^__ 0,2 мл 0,1н НСl и 0,8 мл воды (рН 5,0), в третью ^__ 1 мл воды (рН 7,0), в четвертую ^__ 1 мл 0,1н NаОН (рН 9,0). Внести в каждую по 3 мл вытяжки фермента, перемешать и оставить на 15 мин при комнатной температуре. Пока идет расщепление крахмала, в 4 пробирки 2-го ряда налить по 5 мл разбавленного раствора йода. Через 15 мин из каждой пробирки с соответствующем значением рН взять по 1,0 мл реакционной смеси и внести в пробирки с йодом. По характеру продуктов гидролиза при различных значениях рН оценить активность фермента в баллах. Результаты записать по форме табл. 1.

Таблица 1

 

рН	Продукты гидролиза	Активность фермента, балл
название	окраска (рисунок)

 

 

Построить график зависимости активности амилазы от рН и сделать вывод об значении рН, при котором амилаза максимальна активна.

ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ ПО ТЕМЕ

«ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ. ОСНОВНЫЕ ВЕЩЕСТВА РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ И ИХ ПРЕВРАЩЕНИЯ»

1. В две пробирки налили одинаковое количество вытяжки растительной ткани. Во вторую пробирку добавили немного 20% НС1 и прокипятили. Затем в обе пробирки внесли столько же реактива Фелинга, сколько и вытяжки, и вновь прокипятили. Какие выводы о содержании в материале редуцирующих и нередуцирующих сахаров можно сделать, если: а) в обеих пробирках цвет жидкости не изменился и осадка нет; б) в первой пробирке осадок отсутствует, а во второй появился; в) в первой и второй пробирках выпало в осадок одинаковое количество закиси меди; г) в первой пробирке количество осадка соответствует 2 баллам, во второй — 4 баллам.

2. Водный экстракт белков из клубней картофеля дал более четкую биуретовую реакцию, чем экстракт с помощью слабых нейтральных солей. Почему?

3. В непроросших семенах льна не обнаружены углеводы. При их прорастании появляется крахмал и растворимые сахара. Каково их происхождение?

4. В непроросших семенах фасоли много крахмала (4 балла). В прорастающих семенах количество его снижается почти вдвое, но содержание редуцирующих сахаров оказывается незначительным. Почему?

5. Какие запасные вещества преобладают в семенах большинства видов растений, почему?

6. Почему подмороженные клубни картофеля приобретают сладкий вкус?

7. В три пробирки налили одинаковое количество крахмального клейстера, добавили по 0,5 мл вытяжки амилазы и выдержали в течение 15 мин при 0,35 и 100°. После добавления йода продукты в первой пробирке дали фиолетовую окраску, во второй — желтую, в третьей — синюю. Объяснить полученный результат.

8. Изучали зависимость глубины гидролиза крахмала от времени действия фермента. Однако вместо ожидаемого последовательного изменения окраски образующихся под действием йода декстринов от фиолетовой через красную, оранжевую к желтой во всех пробирках был голубовато-желтый цвет. В чем причина неудачи опыта? Играет ли роль качество крахмала, а именно — соотношение составляющих его полимеров?

9. На пластинку из крахмально-желатиновой смеси поместили срезы сухих и набухших семян кукурузы и подсолнечника. Через 40 мин семена убрали и пластинку залили разбавленным раствором иода. Каков ожидаемый результат опыта, почему?

10. В каких органах дыхание протекает более интенсивно: листьях, цветах, стеблях, почках, в запасающей паренхиме?

11. В каких тканях интенсивность дыхания выше: в тапетуме пыльников или мякоти яблока; в кожуре, глазках или, запасающей паренхиме клубней, картофеля? Почему?

12. 15 г почек выделили за 30 мин 3 мг СО₂. Определить интенсивность дыхания на 1 г сухого веса в час, если известно, что сухое вещество в почках составляет 40%.

13. Сколько СО₂ выделяет 1 кг семян за 10 суток, если известно, что интенсивность дыхания этих семян равна 0,1 мг СО₂ на 1 г сухого вещества в час (сухое вещество в семенах составляет 63%)?

14. Вредно ли в помещении содержать декоративные растения, поглощающие кислород, необходимый человеку? Какое количество кислорода поглотят растения общим весом 2 кг в комнате объемом 45 м² за 10 ч, если известно, что средняя интенсивность их дыхания 12 мл О₂ на 1 г в сутки? Доказательство подтвердить расчетом.

15. На свету при 25° растение интенсивно поглощало СО₂. При повышении температуры до 40° поглощение СО₂ сменилось его интенсивным выделением. Объяснить причину изменения газообмена.

16. Почему для лучшей сохранности овощей в хранилище, поддерживается низкая температура?

17. Каков будет состав запасных веществ семян, если их дыхательный коэффициент равен 0,3; 0,8; 1,0?

18. В наклюнувшихся семенах ячменя ДК был равен 0,8. При дальнейшем прорастании семян он поднялся до 1,4. Почему?

19. Почему зерно, заложенное на хранение, должно иметь влажность не выше 12—14%? Что произойдет, если влажность зерна будет выше?

20. Какую роль играет кислород в процессах дыхания?

21. Какое минимальное содержание кислорода во внешней среде не оказывает отрицательного влияния на продуктивность дыхания?

22. Объясните причины накопления спирта в плодах?

23. При каких условиях в семенах накапливается спирт?

24. Может ли накапливаться спирт в корневой системе?

25. Почему растения не могут длительное время находиться в среде бедной кислородом, хотя и не погибают сразу после попадания в анаэробные условия?

26. Как влияет повышение влажности семян на интенсивность их дыхания?

27. Некоторые растения (фикусы, орхидеи и др.) формируют воздушные корни. Какова их роль в жизни растений?

28. Является ли отсутствие высокой ферментативной активности в гомогенате растительной ткани доказательством того, что этот фермент малоактивен и в самом растении?

29. Почему после первых морозов становятся более сладкими и вкусными ягоды рябины, калины и некоторых других растений?

30. Как влияет температура на интенсивность дыхания растений?

31. С какой целью в пивоварении используют гиббереллин?