Работа 3. Обнаружение активности каталазы в растительном материале.

 

Цель: обнаружить и сравнить активность каталазы в различном растительном материале.

 

Объекты, реактивы, оборудование: листья комнатных растений разного возраста, сухие, набухшие и наклюнувшиеся семена ячменя, проростки различных двудольных растений, клубни и корнеплоды; 3% Н₂О₂, песок для растирания ткани; пробирки; цилиндры на 10 мл, фарфоровые ступки с пестиком, воронки, пробочные сверла, держатели и штативы для пробирок.

Краткие сведения

Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Он представляет собой железопротеид. Небелковая часть, как у пероксидазы, представлена железопорфирином. Деятельность каталазы в живой клетке сопряжена с активностью флавопротеидов ^__ важнейшего звена ЭТЦ дыхания. Каталаза расщепляет токсичную для живой клетки перекись водорода, образующуюся как побочный продукт деятельности флавопротеидов в пероксисомах.

Реакция идет согласно уравнению

каталаза

Н₂ О₂ + Н₂О₂ О₂ + 2Н₂О

 

Полагают, что в очень мясистых тканях, лишенных достаточного доступа кислорода, каталаза играет роль поставщика последнего, генерируя его из перекиси водорода.

Ход работы

Из листа растения пробочным сверлом диаметром 1 см сделать 5 высечек, не захватывая крупные жилки. При работе с мясистыми органами растений (клубни, корнеплоды), перед тем как делать высечки, следует нарезать ткань пластинками толщиной 4–5 мм. Диски растереть в ступке с добавлением небольшого количества воды (до 1 мл). Если ткань жесткая, добавить немного песка. К растертой кашице прилить 5 мл воды тщательно перемешать и профильтровать в чистую пробирку через увлажненный складчатый фильтр. Для работы достаточно 3–4 мл вытяжки фермента. Добавить к вытяжке 2 мл 3% перекиси водорода. В результате разложения перекиси водорода ферментом выделяются пузырьки кислорода, дающие хорошо заметную пену. Для сравнения активности каталазы в различных объектах следует брать равное по сухой массе количество материала.

Активность фермента оценить в баллах: интенсивное образование пены ^__ 4 балла, умеренное ^__ 3, слабое ^__ 2, очень слабое ^__ 1 балл, отсутствие активности ^__ 0 баллов.

Результаты записать по форме табл.1.

Таблица 1

Вариант опыта	Активность каталазы, балл

Используя активность каталазы как косвенный показатель интенсивности дыхания, сделать вывод о зависимости активности каталазы и (косвенно) интенсивности дыхания от изучаемых внутренних и внешних факторов.

Задача. Определить активность каталазы:

1) в молодых, зрелых и старых листьях;

2) в зрелых листьях различных видов растений (хлорофитум, узумбарская фиалка, пеларгония);

3) в различные органах растения (корень, стебель, лист);

4) в наружных и внутренних частях мясистых органов растений (клубни, корнеплоды);

5) в сухих, набухших и наклюнувшихся семенах ячменя.

Общие результаты работы по вариантам записать по образцу табл.1, вычислить среднюю для каждого варианта.

 

 

Работа 4. Обнаружение активности пероксидазы

Цель: обнаружить и сравнитьактивность пероксидазы в различных растительных объектах

 

Объекты, реактивы, оборудование: листья разного возраста, проростки растений, клубни картофеля, корнеплоды, сухие и наклюнувшиеся семена; 0,3% Н₂О₂, раствор бензидина; пробирки, воронки, пипетки на 2 мл, штативы для пробирок, ступки фарфоровые, лезвия, фильтровальная бумага.

Краткие сведения

Пероксидаза является протеидом, состоящим из белка и простетической группы – железопорфирина. Установлено, что пероксидаза катализирует окисление различных циклических (фенолы, ароматические амины) и гетероциклических соединений кислородом перекиси водорода. Реакция идет согласно уравнению:

Перекись водорода образуется в клетке как побочный продукт каталитической деятельности флавиновых дегидрогеназ в электрон-транспортной цепи дыхания. Таким образом, деятельность пероксидазы по утилизации токсичной для клетки перекиси водорода косвенно связана с основной ЭТЦ дыхания.

Вместе с тем установлено, что пероксидаза способна функционировать как типичная оксидаза, катализируя окисление субстрата кислородом воздуха:

Е пероксидаза

Субстрат → НАД·Н₂ → ФП → ц.х.В → ц.х.С → ЦХО → О₂

Н⁺ пероксидаза

е^-

1/2О₂→ →Н₂О

 

Так, пероксидаза с одной стороны, может окислять кислородом воздуха НАД·Н₂, с другой ^___ передавать электроны, полученные от него, на различные акцепторы (например, на цитохром С). В обоих случаях пероксидаза является звеном ЭТЦ дыхания.

Пероксидаза обнаружена практически во всех органоидах клетки и в цитоплазме. Ее легко выделить растиранием растительной ткани в воде или ацетатном буфере (рН 5,4). Обнаружение активности пероксидазы основано на ее способности в присутствии Н₂О₂ окислять бесцветные фенольные соединения до окрашенных хинонов.

Ход работы

При определении активности пероксидазы растительную ткань (около 200 мг) растереть в ступке с водой, слить в пробирку и довести водой до 5 мл. Для сравнения активности пероксидазы в различных объектах следует брать равное по сухой массе количество материала. Полученную смесь отфильтровать в сухую пробирку через увлажненный складчатый фильтр. Количество фильтрата должно быть около 2 мл. К этой вытяжке добавить 2 мл 0,3% перекиси водорода и 2 мл 1,5% раствора бензидина. Встряхнуть пробирку и через 30 с определить интенсивность посинения по 4-балльной шкале.

Результаты записать по форме табл.1.

Таблица 1

Вариант опыта	Активность пероксидазы, балл

 

Сделать вывод об активности пероксидазы в исследуемых объектах.

Задача. Изучить активность пероксидазы в зависимости:

1) от степени прорастания семян (сухие, наклюнувшиеся);

2) от видовой специфики запасающей ткани разных видов растений (мякоть картофеля, яблока, моркови);

3) от типа ткани определенного органа (кожура, глазки, мякоть клубня картофеля);

4) от возраста листа (молодой, зрелый, старый).