Потребности прокариот в пит.веществах. Факторы роста микроорганизмов. Способы и типы питания. Поступление пит.веществ в клетку. Обмен веществ между клеткой и средой.

Мономеры, необходимые для построения основных клеточных компонентов, могут быть синтезированы клеткой или поступать в готовом виде из среды. Чем больше готовых соединений должен получать организм извне, тем ниже уровень его биосинтетических способностей, так как химическая организация всех свободноживущих форм одинакова.

Источники углерода

В конструктивном метаболизме основная роль принадлежит углероду, поскольку все соединения, из которых построены живые организмы, — это соединения углерода. Их известно около миллиона. Прокариоты способны воздействовать на любое известное углеродное соединение, т. е. использовать его в своем метаболизме. В зависимости от источника углерода для конструктивного метаболизма все прокариоты делятся на две группы: автотрофы, к которым принадлежат организмы, способные синтезировать все компоненты клетки из углекислоты, и гетеротрофы, источником углерода для конструктивного метаболизма которых служат органические соединения¹⁵. Понятия "авто-" и "гетеротрофия" характеризуют, таким образом, тип конструктивного метаболизма. Если автотрофия — довольно четкое и узкое понятие, то гетеротрофия — понятие весьма широкое и объединяет организмы, резко различающиеся своими потребностями в питательных веществах.

Впервые понятия "авто-" и "гетеротрофия" были введены для противопоставления растительного и животного образа жизни. Позднее их распространили на все другие организмы, в том числе и на прокариотные. Термин "автотрофия" означает питающийся самостоятельно, "гетеротрофия"—питающийся другими; от греческих слов: autos—сам, heteros— другой, trophe — пища.

Наибольшая степень гетеротрофности присуща прокариотам, относящимся к облигатным внутриклеточным паразитам, т. е. организмам, которые могут жить только внутри других живых клеток. Паразитический образ жизни привел к редукции некоторых метаболических путей у этих прокариот, что и обусловило полную их зависимость от метаболизма клетки хозяина.

Другие паразитические прокариотные организмы удается выращивать на искусственных средах, но состав таких сред необычайно сложен. Они содержат, как правило, белки или продукты их неглубокого гидролиза (пептиды), полный набор витаминов, фрагменты нуклеиновых кислот и т. д. Для приготовления питательных сред такого состава используют мясные гидролизаты, цельную кровь или ее сыворотку. Формы, способные расти при создании подходящих условий вне клетки хозяина, называют факультативными паразитами.

Следующую крупную группу прокариот составляют так называемые сапрофиты — гетеротрофные организмы, которые непосредственно от других организмов не зависят, но нуждаются в готовых органических соединениях¹⁶. Они используют продукты жизнедеятельности других организмов или разлагающиеся растительные и животные ткани. К сапрофитам относится большая часть бактерий. Степень требовательности к субстрату у сапрофитов весьма различна. В эту группу входят организмы, которые могут расти только на достаточно сложных субстратах (молоко, трупы животных, гниющие растительные остатки), т. е. им нужны в качестве обязательных элементов питания углеводы, органические формы азота в виде набора аминокислот, пептидов, белков, все или часть витаминов, нуклеотиды или готовые компоненты, необходимые для синтеза последних (азотистые основания, пятиуглеродные сахара). Чтобы удовлетворить потребность этих гетеротрофов в элементах питания, их обычно культивируют на средах, содержащих мясные гидролизаты, автолизаты дрожжей, растительные экстракты, молочную сыворотку.

Есть прокариоты, требующие для роста весьма ограниченное число готовых органических соединений в основном из числа витаминов и аминокислот, которые они не в состоянии синтезировать сами, и наконец, гетеротрофы, нуждающиеся только в одном органическом источнике углерода. Им может быть какой-либо сахар, спирт, кислота или другое углеродсодержащее соединение. Описаны бактерии из рода Pseudomonas, способные использовать в качестве единственного источника углерода и энергии любое из 200 различных органических соединений, и бактерии, для которых источником углерода и энергии может служить узкий круг довольно экзотических органических веществ. Например, Bacillus fastidiosus может использовать только мочевую кислоту и продукты ее деградации, а некоторые представители рода Clostridium растут только в среде, содержащей пурины. Использовать другие органические субстраты для роста они не могут. Биосинтетические способности этих организмов развиты в такой степени, что они сами могут синтезировать все необходимые им углеродные соединения.

Термин "сапрофиты" происходит от греческих слов sapros — гнилой и phyton—растение.

Особую группу гетеротрофных прокариот, обитающих в водоемах, составляют олиготрофные бактерии, способные расти при низких концентрациях в среде органических веществ. Организмы, предпочитающие высокие концентрации питательных веществ, относят к копиотрофам¹⁷. Если у типичных копиотрофов оптимальные условия для роста создаются при содержании в среде питательных веществ в количестве примерно 10 г/л, то для олиготрофных организмов — в пределах 1—15мг углерода/л. В средах с более высоким содержанием органических веществ такие бактерии, как правило, расти не могут и погибают.

Термины происходят от греческих слов oligos — малый и trophe — пища, латинского copia — изобилие.

Различия между гетеротрофными прокариотами с высокими потребностями в готовых органических соединениях и теми, потребности которых минимальны и сводятся, как правило, к одному какому-нибудь органическому источнику углерода, заключаются, таким образом, в степени развития их биосинтетических. способностей. Крайняя степень развития биосинтетических способностей — способность строить все клеточные компоненты из углекислоты — присуща группе автотрофных прокариот.

Как можно видеть из изложенного выше, в мире прокариот не существует резкой границы между авто- и гетеротрофными организмами, так же как нет ее в ряду одноуглеродных соединений (CO₂, CO, HCOOH, НСНО, CH₃OH, CH₄), каждое из которых может служить источником углерода для определенной группы прокариот. Однако использование термина "автотрофия" удобно для обозначения конкретного типа конструктивного метаболизма, поскольку в процессе эволюции он оказался специфически связанным с определенными видами энергетических процессов, что привело к появлению у прокариот таких типов жизни, которые отсутствуют у более высокоорганизованных форм.

Азот

Азот (наряду с углеродом, водородом и кислородом) является одним из четырех основных элементов, участвующих в построении клетки. В расчете на сухие вещества его содержится приблизительно 10%. Природный азот бывает в окисленной, восстановленной и молекулярной формах. Подавляющее большинство прокариот усваивают азот в восстановленной форме. Это соли аммония, мочевины, органические соединения (аминокислоты или пептиды). Окисленные формы азота, главным образом нитраты, также могут потребляться многими прокариотами. Так как азот в конструктивном клеточном метаболизме используется в форме аммиака, нитраты перед включением в органические соединения должны быть восстановлены.

Восстановление нитратов до аммиака осуществляется посредством последовательного действия двух ферментов — нитрат- и нитритредуктазы. Нитратредуктаза катализирует НАД·H₂-зависимое¹⁸ восстановление нитрата до нитрита:

NO₃^– + НАД·H₂ ® NO₂^–+НАД⁺+H₂O,

в результате которого осуществляется перенос на NO₃^– двух электронов. Нитритредуктаза катализирует шестиэлектронное восстановление NO₂^– до NH₃:

NO₂^– + ЗНАД·H₂ + Н⁺ ® NH₃ + 3НАД⁺+2H₂O.

¹⁸ НАД (Ф)⁺— окисленная, НАД (Ф) — H₂—восстановленная и НАД (Ф)— обобщенная формы кофермента никотинамидадениндинуклеотида или никотинамидадениндинуклеотидфосфата.

До момента появления NH₃ никаких свободных промежуточных продуктов не обнаружено.

Молекулы мочевины и органических соединений также должны быть подвергнуты соответствующим ферментативным воздействиям, сопровождающимся высвобождением аммиака. Давно была обнаружена способность отдельных представителей прокариотного мира использовать молекулярный азот атмосферы. В последнее время показано, что этим свойством обладают многие прокариоты, принадлежащие к разным группам: эу- и архебактерии, аэробы и анаэробы, фототрофы и хемотрофы, свободноживущие и симбиотические формы. Фиксация молекулярного азота также приводит к восстановлению его до аммиака.

Потребности в источниках серы и фосфора

Сера входит в состав аминокислот (цистеин, метионин), витаминов и кофакторов (биотин, липоевая кислота, кофермент А и др.), а фосфор — необходимый компонент нуклеиновых кислот, фосфолипидов, коферментов. В природе сера находится в форме неорганических солей, главным образом сульфатов, в виде молекулярной (элементной) серы или входит в состав органических соединений. Большинство прокариот для биосинтетических целей потребляют серу в форме сульфата, который при этом восстанавливается до уровня сульфида. Однако некоторые группы прокариот не способны к восстановлению сульфата и нуждаются в восстановленных соединениях серы. Основной формой фосфора в природе являются фосфаты, которые и удовлетворяют потребности прокариот в этом элементе.

Необходимость ионов металлов

Всем прокариотным организмам необходимы металлы, которые могут использоваться в форме катионов неорганических солей. Некоторые из них (магний, кальций, калий, железо) нужны в достаточно высоких концентрациях, потребность в других (цинк, марганец, натрий, молибден, медь, ванадий, никель, кобальт) невелика. Роль перечисленных выше металлов определяется тем, что они входят в состав основных клеточных метаболитов и, таким образом, участвуют в осуществлении жизненно важных функций организма.

Потребность в факторах роста

Некоторые прокариоты обнаруживают потребность в одном каком-либо органическом соединении из группы витаминов, аминокислот или азотистых оснований, которое они по каким-то причинам не могут синтезировать из используемого источника углерода. Такие органические соединения, необходимые в очень небольших количествах, получили название факторов роста. Организмы, которым в дополнение к основному источнику углерода необходим один или больше факторов роста, называют ауксотрофами, в отличие от прототрофов, синтезирующих все необходимые органические соединения из основного источника углерода.

Микроорганизмов факторы роста

биологически активные вещества (ряд аминокислот, витамины, пуриновые и пиримидиновые основания, стерины и др.), в отсутствии которых многие микроорганизмы не растут даже на питательных средах, содержащих необходимые источники энергии, углерода и азота. М. ф. р. оказывают действие в ничтожных количествах. Неспороносные бактерии (Pseudomonas, Mycobacterium), многие плесневые грибы (Aspergillus, Penicillium) и др. микроорганизмы не нуждаются в М. ф. р., так как способны их синтезировать.

Аминокислоты необходимы для биосинтеза белка, пуриновые и пиримидиновые основания — для образования нуклеиновых кислот. Среди М. ф. р. особенно важны витамины, являющиеся коферментами многих ферментов. Так, пиридоксин (витамин B₆) участвует в переаминировании и дезаминировании аминокислот, Тиамин (витамин B₁) — в декарбоксилировании и т. д. Некоторые виды дрожжей, молочнокислые бактерии не растут на питательных средах без биотина, тиамина, пантотеновой и никотиновой кислот, пиридоксина и др. Считали, что некоторые болезнетворные микроорганизмы растут только на средах, содержащих кровь или её сыворотку, асцитическую жидкость, молочную сыворотку, дрожжевой автопизат. Оказалось, что эти микробы могут расти и без таких веществ, если к питательной среде добавить соответствующие М. ф. р. Если М. ф. р. имеют сложное химическое строение, то потребность в них у разных микроорганизмов может варьировать. Так, в состав молекулы тиамина входят остатки тиазола и пиридина. Одни виды нуждаются в готовом тиамине, другие синтезируют его, если в среде есть тиазол и пиридин, третьи растут на среде с тиазолом, т. к. синтезируют пиридин, а затем и тиамин, четвёртые размножаются в присутствии пиридина, синтезируя тиазол, а потом и тиамин. Т. н. дикие формы микроорганизмов, способные к синтезу М. ф. р., называются прототрофными. Воздействуя на них мутагенами, можно получить мутанты, нуждающиеся в том или ином М. ф. р. Их называют ауксотрофными или дефицитными мутантами и применяют для количественного определения витаминов, аминокислот и т. д., а также при селекции мутантов, образующих повышенные количества этих веществ. Способность к синтезу М. ф. р. может определять характер взаимоотношений между организмами. Так, если определённый вид дрожжей не растет из-за отсутствия в питательной среде М. ф. р., то подсев и размножение вида, синтезирующего их, приведёт к одновременному росту обоих видов. У некоторых насекомых и ракообразных имеются микроорганизмы-симбионты, размножающиеся в кишечнике или особых органах и снабжающие организм хозяина различными витаминами, аминокислотами и т. п. Микроорганизмы, обитающие в рубце и кишечнике жвачных, а также в кишечнике др. животных и человека, выполняют ту же функцию.

 

Бактерии, как и все другие организмы, для существования и воспроизводства себе подобных нуждаются в постоянном обмене веществ с окружающей средой. Превращения веществ в клетке (метаболизм) представлены противоположными, но и взаимосвязанными процессами, направленными, во-первых, на распад сложных питательных веществ на более простые, это звено метаболизма называется катаболизмом, а, во-вторых, на превращения простых веществ в ходе реакций промежуточного обмена в более сложные низкомолекулярные соединения, из которых далее синтезируются полимерные макромолекулы. Это второе звено метаболизма называется анаболизмом.
Для осуществления процессов метаболизма питательные вещества проникают в бактериальную клетку извне через цитоплазматическую мембрану, при этом, клеточная стенка не служит препятствием для прохожден ия ио нов и мелких молекул. Мембранные белки - пермеазы или транслоказы - обладают ферментативными свойствами и помогают осуществлять транспорт веще ств в кл етку. Различают три механизма транспорта, два из них обеспечивают только передачу, но не накопление веще ств в кл етке. Это простая или пассивная диффузия и облегченная диффузия. Простая диффузия не специфична, для нее имеет значение только величина молекул. Путем простой диффузии в клетку проникают чужеродные для нее вещества - яды, ингибиторы, лекарственные препараты. При облегченной диффузии в клетку проникают те молекулы, концентрация которых в цитоплазме ниже, чем в окружающей среде. Этот процесс осуществляется благодаря субстрат-специфической пермеазе. Затрат энергии при этом не происходит. Третий механизм питания клетки - активный транспорт. Он тоже происходит с участием субстратных белков ферментов, но при этом затрачивается энергия, а проникшие в клетку вещества накапливаются в ней. Молекулы, проникшие в клетку путем активного транспорта через мембрану, претерпевают химические превращения, например, фосфорилирование.
Выход продуктов метаболизма из бактериальной клетки в окружающую среду так же осуществляется путем неконтролируемой диффузии или при участии транспортных систем - в тех случаях, когда в результате процессов брожения, неполного окисления или нарушений метаболизма вещества накапливаются в клетке в количествах, превышающих физиологическую норму.
Для роста и размножения бактерий, а, следовательно, и для их питания, необходимы различные химические соединения, растворенные в воде. По количественному вкладу в построение клетки различают макро- и микроэлементы. К макроэлементам относят 10 элементов таблицы Менделеева: углерод, водород, кислород, азот, серу, калий, кальций, фосфор, магний, железо. Микроэлементы нужны бактериям в очень малых, следовых, количествах, они представлены марганцем, молибденом, цинком, медью, кобальтом, никелем, хлором, бромом и некоторыми другими металлами и неметаллами. Большинство из них содержится в виде примесей в макроэлементах или может попадать в питательные среды из стеклянной посуды, воды или воздуха. Некоторые бактерии могут обходится и без микроэлементов.
По потребности в углероде бактерии делятся на две большие группы: автотрофы или органотрофы и гетеротрофы или литотрофы.
Бактерии - автотрофы способны получать энергию путем окисления неорганических соединений, они, как правило, используют СО₂ как основной источник, содержащий углерод в наиболее окисленной форме. Поэтому при культивировании автотрофов необходимо обеспечить клетки углекислотой, так как концентрация СО₂ в воздухе не превышает 0,03%, и ее поступление в среду за счет диффузии недостаточно для роста микроорганизмов. В питательные среды для культивирования автотрофов вносят карбонат кальция (СаСО₃) или бикарбонат натрия (NaНСО₃). Иногда через питательную среду продувают воздух, обогащенный 1-5% СО₂.
Бактерии - гетеротрофы получают углерод из органических соединений. В зависимости от индивидуальных особенностей микроорганизмов источником углерода могут быть разные органические соединения - спирты, углеводы, ароматические соединения, органические кислоты.
Гетеротрофы, в свою очередь, разделяются на сапрофитов (метатрофов), живущих за счет органических соединений, поступающих в бактериальную клетку из внешней среды и паразитов (паратрофов), способных утилизировать только продукты метаболизма внутри живой клетки. Паразитизм может быть факультативным и абсолютным или облигатным.
Для роста микроорганизмов так же необходим азот, который входит в состав органических соединений или солей в разной степени восстановления. Это могут быть соли аммония, нитраты или отдельные аминокислоты. Для удовлетворения потребности бактерий в азоте используют также продукты неполного расщепления белков животного происхождения - гидролизаты, пептоны и сложные белковые смеси - нативную сыворотку животных, асцитическую жидкость и др.
Кроме углерода, азота и других химических элементов, многие бактерии нуждаются в факторах роста, к которым относятся витамины, основания нуклеиновых кислот и другие биологически активные вещества. По этому признаку микроорганизмы можно разделить на две группы: ауксотрофы, для которых в среде необходимо наличие одного или нескольких факторов роста и прототрофы, они в факторах роста не нуждаются.
В среде обитания бактерий кроме биосинтетического должен находиться и энергетический материал. По способу получения энергии бактерии также принято делить на две группы: хемотрофы и фототрофы. Хемотрофы используют энергию окисления различных соединений. В зависимости от окисляемого субстрата среди хемотрофных организмов выделяют хемолитотрофы и хемоорганотрофы. Фототрофы для удовлетворения энергетических потребностей используют энергию света.

Поступление веществ в клетку и выделение продуктов обмена в окружающую среду происходит у микроорганизмов через всю поверхность тела путем осмоса или адсорбции. На интенсивность этих процессов оказывают различные факторы: разность концентрации питательных веществ в клетке и за ее пределами, а также проницаемость для них плоуменной оболочки.

Осмос представляет собой диффузию веществ в растворах через полупроницаемую мембрану.

Возникает осмос под действием разности осмотических давлений в растворах по обе стороны полупроницаемой мембраны. Величина осмотического давления раствора зависит от молярной концентрации растворенных в нем веществ.

Оболочка клетки проницаема и задерживает лишь микромалекулы. Цитоплазматическая мембрана клетки обладает полупроницаемостью: она является осмотическим барьером, регулируя поступление в клетку и выход из нее растворенных веществ. Вещества не растворимые в воде, белки, не могут быть использованы клеткой. Они могут проникнуть в нее лишь после расщепления на более простые, что происходит с помощью экзоферментов микробов.

Таким образом, при осмотическом проникновении пит.веществ в клетку движущей силой служит разность осмотических давлений между средой и клеткой. Такой пассивный перенос веществ не требует затраты энергии и протекает до выравнивания концентрации с наружным раствором.

Поступившие в клетку вещества включаются в реакцию конструктивного и энергетического обмена, концентрация некоторых из них будет ниже, чем в среде, и поступление данных веществ возможно до полного исчерпания их из субстрата.

Если микроорганизм попадает в субстрат, осмотическое давление которого выше, чем в клетке, то цитоплазма отдает воду во внешнюю среду. Питательные вещества в клетку не поступают, содержимое клетки уменьшается в объеме и протопласт отстает от клеточной оболочки. Это явление называется плазмолизом клетки.

При чрезмерном низком осмотическом давлении внешней среды может наступить плазмоптис клетки - явление обратное плазмолизу, когда вследствии высокой разности осмотических давлений цитоплазма переполняется водой и приводит к разрыву клеточной оболочки.

Второй путь поступления веществ в клетку - активный. Путем переноса их особыми, локализованными в цитоплазматической мембране веществами ферментной природы. Эти перегсчики, называемые пермеазами, обладают субстратной специфичностью.

Каждый транспортирует только определенное вещество. На внешней стороне цитоплазматической мембраны переносчик адсорбирует вещество вступает с ним во временную связь и отдает на внутренней стороне ее транспортируемое вещество в цитоплазму.

Основные понятия культивирования бактерий. Искусственные питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами подписывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содер­жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.
Питательные среды готовят из продуктов животного или рас­тительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины груп­пы В, никотиновая кислота и др.).
Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.
В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.
По консистенции питательные среды могут быть жид­кими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до­бавления к жидкой среде 1,5—2% агара, полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо­бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80—86°С, затвердевает при температуре около 40°С и в застыв­шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10—15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сы­воротка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными. По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференци­ально-диагностические. Основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду — питательный бульон и плотную — пита­тельный агар. Такие среды служат основой для приготов­ления сложных питательных сред — сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.
Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов определен­ного вида (или определенной группы) из материалов, содержа­щих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особен­ностей, которые отличают данные микроорганизмы от большин­ства других. Например, избирательный рост стафилококков на­блюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, хо­лерного вибриона — в щелочной среде и т. д.
Дифференциально-диагностическиепитательные среды при­меняются для разграничения отдельных видов (или групп) мик­роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи­мической активности вследствие неодинакового набора фермен­тов.
Особую группу составляют синтетические и полусинтетиче­ские питательные среды. В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследовательской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.