Анализ качества осахаривающих материалов. Часть I

Цель работы: изучить требования, предъявляемые к осахаривающим материалам, используемым в спиртовой промышленности; освоить фотоэлектроколориметрический метод определения амилолитической и глюкоамилазной активности ферментных препаратов, активности амилолитических и осахаривающих ферментов свежепроросшего солода.

Аппаратура и реактивы:

- фотоэлектроколориметр;

- водяная баня, лабораторная посуда, пипетки;

- 1 %-ный раствор крахмала;

- буферные растворы ацетатный, рН 4,7; фосфатный, рН 6,0;

- 0,1 н и 0.5 н растворы соляной кислоты;

- основной раствор йода;

- рабочий раствор йода, дистиллированная вода;

- амилолитические ферментные препараты.

 

Задание 1 По лекциям, справочной и нормативной литературе изучить требования, предъявляемые к осахаривающим материалам, используемым в спиртовой промышленности [2, 3, 4].

При выполнении лабораторной работы подгруппа делится на бригады, каждая из которых анализирует образцы концентрированных ферментных препаратов, полученных с применением продуцентов – микроскопических грибов или бактерий, а также образцы свежепроросшего солода.

Задание 2 Определение активности амилолитических ферментов

2.1 Фотоколориметрический метод

Метод, разработанный во ВНИИПБ А. П. Рухлядевой и М. Г. Горя­чевой, основан на определении скорости ферментативной реакции гид­ролиза крахмала, которую устанавливают по количеству крахмала, прогидролизованного в процессе колориметрической реакции с йодом.

Гидролизаты в основном состоят из декстринов с различной молекулярной массой, которые с йодом дают различную окраску: амилодек-стрины (9-17%) дают с йодом фиолетовую окраску, (α)²⁰_D = 196°, растворимы в 25 %-ном этиловом спирте; эритродекстрины (26-65%) дают с йодом красно-бурую окраску, растворимы в 55 %-ном этиловом спирте, (α)²⁰_D = 194°; ахродекстрины (5-15%) не окрашиваются йодом, растворимы в 70 %-ном этиловом спирте, (α)²⁰_D = 192°; мальтодекстрины йодом дают бесцветные растворы, растворимы в этиловом спирте, определяются вместе с сахарами, (α)²⁰_D в пределах 181-183°.

Таким образом, под действием α-амилазы образуются из крахмала продукты, суммарная окраска которых с йодом отличается от таковой исходного субстрата (крахмал с йодом имеет ярко-синюю окраску).

В гидролизатах содержится от 7 до 36% спирторастворимых углеводов. В состав этих углеводов могут входить мальтодекстрины, олигосахариды (ди-, три- и тетрасахариды), т. е. полисахариды, состоящие и небольшого числа остатков моноз, и моносахариды. Редуцирующих углеводов в этой группе содержится 30% в пересчете на глюкозу.

Из олигосахаридов главной составляющей частью гидролизатов может быть мальтоза. Она представляет собой α-глюкопиранозидоглюкозу. Растворы мальтозы сильно вращают плоскость поляризации впра­во и обнаруживают свойства мутаротации. Мальтоза имеет одну альде­гидную группу и восстанавливает Фелингову жидкость.

Из олигосахаридов в состав гидролизатов входят изомальтоза, мальтотриоза и мальтотетроза. Из моносахаров в гидролизатах присут­ствует глюкоза, хотя и в небольших количествах. Она принадлежит к D-ряду, который характеризуется определенной конфигурацией пятого асим­метрического атома углерода, наиболее удаленного от карбонильной группы. Эта конфигурация аналогична конфигурации асимметрическо­го атома D-винной кислоты и D-глицеринового альдегида.

У α-конфигурации альдоз гликозидный и соседний с ним гидроксилы (т.е. гидроксилы в положениях 1 и 2) расположены по одну сто­рону от цикла. У β-конфигурации альдоз, которые являются аномерами α-альдоз, гидроксилы расположены по разные стороны цикла.

Как было сказано выше, полученный в результате ферментативной реакции гидролизат дает отличающуюся от исходного раствора крахма­ла окраску с йодом. Эта окраска приобретает фиолетовый или красно-бурый цвет в зависимости от количества фермента, введенного в реак­цию. По изменению окраски реакционной среды, вызывающему сниже­ние оптической плотности раствора, определяют количество превра­щенного крахмала.

Сущность реакции углеводов с йодом заключается в том, что при взаимодействии полисахаридов с этим соединением протекают два про­цесса: комплексообразование, подчиняющееся стехиометрическим от­ношениям, и адсорбция.

При взаимодействии крахмала с йодом в реакцию комплексообразования вступает в первую очередь амилоза. Цепь амилозы в виде спи­рали обвивает молекулы йода, располагающиеся по оси спиралей. На каждую молекулу йода приходится шесть глюкозных остатков. По окончании процесса комплексообразования еще небольшое количество йода может связаться с крахмалом за счет процесса адсорбции.

В амилопектине длинные периферические цепи глюкозных остат­ков реагируют с йодом подобно амилозе, но кроме этого процесса, с самого начала происходит адсорбция йода на крайне неровной поверх­ности молекул этого сильно разветвленного полисахарида.

Оттенок окрашивания полисахаридов с йодом зависит от строения полисахарида, в частности от степени его ветвления, а также от длины периферических цепей. При укорачивании этих цепей уменьшается число определенным образом ориентированных молекул йода в спира­лях и изменяется окраска с йодом, что наблюдается, в частности, у дек­стринов.

По количеству превращенного крахмала по графикам определяют количество единиц декстриногенной активности, взятых на фермента­тивную реакцию.

Вследствие специфичности ферментного комплекса и различного свойства α-амилазы у материалов различного происхождения - гриб­ных, бактериальных, а также солодовых - зависимость степени гидро­лиза крахмала от количества введенных в реакцию единиц фермента будет несколько иная.

При определении активности ферментного материала каждого вида для расчета применяют свое специфичное уравнение.

За единицу амилолитической активности (АС) принимают такое ко­личество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г крахмала за 1 ч. Это количество составляет 30% крахмала, взятого для ферментативной реакции, которая проводится при температуре 30°С и рН среды: 4,7 – для грибных препаратов, 6,0 - для бактериальных и 4.8-4.9 - для солодовых.

Амилолитическая активность характеризуется количеством единиц фермента, содержащихся в 1 г твердых, в 1 см³ (или 100 см³) жидких исследуемых продуктов.

Метод определения амилолитической активности предназначен для анализа ферментных препаратов грибного и бактериального происхождения и полупродуктов, полученных с их применением. Этим методом возможно также определять активность культур микроорганизмов процессе их культивирования.

Реактивы:

- 1 %-ный раствор крахмала;

- буферные растворы ацетатный, рН 4,7; фосфатный, рН 6,0;

- 0,1 н и 0.5 н растворы соляной кислоты;

- основной раствор йода;

- рабочий раствор йода.

Подготовка к анализу

Для проведения анализа должна быть отобрана средняя проба продукта с соблюдением требований стандарта на отбор проб.

Активность сухих материалов - концентрированных препаратов солода - дается в единицах на 1 г; жидких (ферментной вытяжки, глубинной культуры, сусла, бражки и т. д.) - в единицах на 1 см³ или 100 см³ продукта.

Амилолитическая активность сыпучих продуктов определяется во влажном материале в пересчете на абсолютно сухое вещество

Приготовление ферментных растворов

Приготовление основного раствора из очищенных препаратов. Из средней пробы тонко измель­ченного препарата берут в стаканчике вместимостью 25-30 см³ навеску 0,100 г, тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством воды и количественно переносят в мерную колбу вместимо­стью 100 см³. Дистиллированной водой доводят объем жидкости до метки при температуре 20°С, перемешивают и при необходимости полученный раствор фильтруют. Фильтрат используют для приготовления рабочего раствора. Последний готовят путем разбавления исходного основного раствора так, чтобы в 5 см³ рабочего раствора содержалось от 0,10 до 0,45 ед. фермента. Под действием этого количества фермента гидролизуется 20-75% крахмала. Количество вытяжки берут в зависимо­сти от активности исследуемого препарата и разбавляют ее дистиллиро­ванной водой до 50 см³, если активность препарата от 20 до 700 ед/г, и до 200 см³ при активности 700 ед/г и выше.

Ориентировочное количество основного раствора препарата, со­держащего 0,1 г препарата в 100 см³ воды, которое необходимо взять для приготовления рабочего раствора нужной концентрации, находят по таблице 3.1.

Таблица 3.1 Получение рабочего и основного растворов в зависимости от активности препарата

АС препарата предполагаемая, ед/г	Предполагаемое содержание препарата в 5 см^3вытяжки, мг	Количество основного раствора, необходимое для вторичного разбавления, см^3	Общий объем рабочего раствора, см^3
25-80	5,0
81-150	2,0
151-300	1,0
301-700	0,5
701-1200	0,25
1201-2500	0,125
2501-5000	0,05
5001 и выше	0,025

Приготовление основного раствора из жидкой культуры мик­роорганизмов (культуральной жидкости, ультраконцентрата) гриб­ного или бактериального происхождения.

В мерную колбу вместимо­стью 100 см³ наливают 90 см³ дистиллированной воды и вносят от 1 до 5 см³ ферментного препарата в зависимости от его предполагаемой ак­тивности. Объем жидкости доводят при 20° С до метки дистиллирован­ной водой. Рабочий раствор готовят из основного, разбавляя его дис­тиллированной водой при 20° С в колбах вместимостью 50 и 100 см³, Учитывая, что объем культуральной жидкости в 5 см³ рабочего раствора должен находиться в пределах 0,01-0,0002 для культуральной жидкости и 0,0002-0,00002 - для ультраконцентрата.

Солод

Солод измельчают на механической или ручной мельнице, отбирают среднюю пробу и определяют влажность. Одновременно из средней пробы берут навеску для определения декстриногенной активности: просяного солода - 10 г, овсяного, ржаного и ячменного - по 5 г.

 

Таблица 3.2 Получение рабочего ферментного раствора из солода в зависимости от его активности

АС солода предполагаемая, ед/г	Предполагаемое содержание солода в 5 см^3 рабочего раствора, мг	Количество основного раствора, необходимое для вторичного разбавления, см^3	Общий объем разбавленного раствора, см^3
Просяной солод
5-10
11-15
16-20
Ячменный, овсяной, ржаной солод
15-20	20,0
21-30	10,0
31-50	7,5

 

Навеску заливают 10 см³ фосфатного буфера с рН 4,8-4,9 и 90 см³ дистиллированной воды. Полученную суспензию для полного извлечения фермента выдерживают в течение 60 мин в термостате с температурой 30° С, периодически перемешивая стеклянной палочкой. Затем суспензию фильтруют и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения декстриногенной активности солода. Для проведения ферментативной реакции используют рабочий раствор, который готовят из основного путем разбавления последнего (таблица 3.2).

Бражка и осахаренное сусло (полуфабрикат при производстве спирта) Для анализа бражки и осахаренного сусла их фильтраты разбавляют в 5-10 раз и получают рабочие растворы, которые используют для проведения ферментативной реакции гидролиза крахмала. Для разбавления берут 20 или 10 см³ фильтрата исследуемого материала, разбавляют в мерной колбе дистиллированной водой до объема 100 см³.

Проведение анализа

Ферментативная реакция гидролиза крахмала проводится в строго определенных стандартных условиях: темпера тура 30° С, рН среды 4,7 для грибных препаратов (с использованием ацетатного буфера), 6,0 для бактериальных препаратов и 4,8-4,9 для солода (с использованием фосфатного буфера); продолжительность реакции 10 мин, начальная концентрация субстрата в реакционной среде 0,65%; объем реакционной смеси 15 см³ (10 см³ субстрата и 5 см³ ферментного раствора).

В две пробирки вместимостью 30 см³ наливают в каждую по10 см³ субстрата и ставят в ультратермостат с постоянной температурой 30±02°С Пробирки выдерживают там в течение 5-10 мин, для того чтобы растворы приняли необходимую температуру. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую 5 см³ дистиллированной воды (контрольная проба), во вторую 5 см³ рабочего раствора фермента (опытная проба), предварительно также нагретого до 30° С. Смеси быст­ро перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 10 мин. По истечении этого времени пробирки с реакционной жидкостью вы­нимают из термостата, отбирают из них по 0,5 см³ и переносят в кони­ческие колбы с предварительно налитыми туда 50 см³ рабочего раствора йода в 0,1 н растворе соляной кислоты при анализе грибных культур и 0,5 н раствора - бактериальных культур. Жидкости перемешивают. При этом одновременно происходят инактивация ферментов и йодокрахмальная реакция. Растворы приобретают окрашивание: контрольный - синий цвет, опытный - фиолетово-бурый; интенсивность окраски зави­сит от степени гидролиза крахмала.

Непосредственно после смешивания определяют оптическую плот­ность растворов на фотоэлектроколориметре, применяя кюветы с толщи­ной поглощающего слоя 10 мм и светофильтр с длиной волны 630-670 нм).

При колориметрировании в качестве раствора сравнения исполь­зуют воду. Анализ проводят по инструкции, приложенной к прибору. Получают два значения оптических плотностей: A₁ - оптическая плот­ность контрольного раствора, характеризующая количество взятого на ферментативную реакцию крахмала 0,1 г; А₂ - оптическая плотность опытного раствора, характеризующая количество крахмала, находяще­гося в реакционной среде. Разница оптических плотностей растворов соответствует тому количеству крахмала субстрата, которое подверга­лось гидролизу под действием фермента исследуемого материала. Ко­личество прогидролизованного крахмала определяют по уравнению (3.1):

С = (А₁-А₂)·0,1/А₁ (3.1)

Если окажется, что крахмала прогидролизовалось более 0,070 или менее 0,020 г, то анализ повторяют. Готовят рабочий раствор с меньшим или большим количеством основного раствора для разбавления. Если в результате ферментативной реакции количество превращенного крахмала находится в указанных пределах, полученные данные используют для определения амилолитической активности.

 

Обработка результатов.

Амилолитическую активность (ед/г или ед/см³) различных материалов определяют по следующим уравнениям:

- для материалов, полученных с грибными продуцентами:

АС = ; (3.2)

- для материалов, полученных с бактериальными продуцентами:

АС = ; (3.3)

- для препаратов бактериального происхождения, содержащих термастабильную α-амилазу:

АС = ; (3.4)

- для солода

АС = , (3.5)

где С – количество превращенного крахмала, г:

а – количество исследуемого материала в реакционной среде, мг.

При вычислении амилолитической активности бражки и сусла пользуются уравнениями (3.2) или (3.5) в зависимости от материала, используемого для осахаривания крахмалистого сырья. Активность указанных полупродуктов выражают в единицах на 100 см³. Поэтому уравнения (3.2) и (3.5) приобретают несколько иной вид:

АС = ; (3.6)

АС = , (3.7)

где V – количество бражки и сусла в реакционной среде, см³.

 

Если осахаривание производится смесью солода и культурами микроорганизмов, то в этом случае активность сусла и бражки рассчитывают по уравнению, выведенному на основе уравнений (3.2) и (3.5). Это уравнение имеет вид:

АС = . (3.8)

Активность грибной глубинной культуры, а также ферментной вы­тяжки выражается в ед/100 см³ и ее определяют по уравнению (3.6).

Коэффициенты расчетных уравнений получены при математиче­ской обработке экспериментальных данных изучения зависимости меж­ду количеством взятого на анализ фермента и степенью гидролиза крахмала (в коэффициенты введен пересчет на 1 ч действия фермента). Активность, полученную с применением разработанного метода, можно выразить в международных стандартных единицах, если условно при­нять за молярную массу крахмала молярную массу остатков глюкозы (180 -18=162), из которых состоит крахмал.

В этом случае под единицей понимают такое количество фермента, которое катализирует превращение одного условного микромоля крах­мала за 1 мин в принятых условиях (мкмоль/(мин·г)). Для расчета ак­тивности в международных единицах необходимо использовать сле­дующие уравнения:

- для препаратов из плесневых грибов:

АС = ; (3.9)

- для бактериальных препаратов:

АС = ; (3.10)

- для солодовых препаратов:

АС = ; (3.11)

- для глубинной культуры грибов, сусла и бражки, осахаренной культурами плесневых грибов:

АС = ; (3.12)

 

- для анализа сусла и бражки, осахаренных солодом:

АС = ; (3.13)

- для анализа сусла и бражки, осахаренных смесью солода и культуры грибов:

АС = . (3.14)

 

Одна условная единица (г/ч·г) содержит 103 стандартные международные единицы с размерностью мкмоль/(мин·г), что видно из следующего расчета:

1 ед. = = 103. (3.15)

 

где 10⁶ - коэффициент перевода граммов в микрограммы;

162 - условное значение молярной массы, г/моль крахмала;

60 - коэффициент перевода часов в минуты.

Фотоколориметрический метод определения амилолитической активности применим для анализа следующих материалов:

- концентрированных ферментных препаратов, полученных применением продуцентов - микроскопических грибов, а также культур и полупродуктов, полученных с их применением;

- концентрированных ферментных препаратов, полученных применением бактерий, а также полупродуктов, полученных с их применением;

- солода различных культур, концентрированных солодовых препаратов, а также полупродуктов, например, сусла и бражки, полученных
при производстве спирта.

 

Пример 1. Определить активность очищенного препарата. Для анализа взят препарат, полученный при глубинном культивировании А. awamori. Приготовленный основной раствор содержит 0,1 г фермента в 100 см³ дистиллированной воды.

Предположим, что препарат имеет активность от 2500 до 5000 ед/г. По таблице 1 находим количество основного раствора (см³), необходимое для вторичного разбавления. Оно равно 2 см³ на 200 см³ воды. Тогда в 5 см³ рабочего раствора будет содержаться 0,05 мг препарата (а).

В результате анализа получены следующие значения оптических плотностей: А₁ = 0,780 и А₂ - 0,500. Количество прогидролизованного крахмала по уравнению (3.1):

С= ·0,1 = 0,0359 г.

Подставляя найденные значения С и а в уравнение (3.2), рассчитаем АС исследуемого препарата:

АС = ед/г.

Для определения активности препарата в международных единицах используют уравнение (10):

АС = = 459 628 ед/г,

Или полученные значения по уравнению 2 в условных единицах умножают на 103:

4462·103 = 459 628 ед/г.

 

Пример 2. Определить активность ячменного солода.

Для анализа взят зеленый ячменный солод. Приготовлен его основной раствор 5 г на 100 см³ дистиллированной воды с фосфатным буфером. Солод хорошего качества, чистый, предположительно имеет активность от 20 до 30 ед/г. По таблице 2 находят количество основного раствора солода, необходимое для приготовления рабочего раствора. Оно равно 2 см³ на 50 см³. Тогда в 5 см³ рабочего раствора солода будет содержаться 10 мг его (а=10мг).

В результате анализа получены следующие значения отических плотностей: А₁ = 0,725, А₂ = 0,388. Используя эти величины, находят количество прогидролизованного крахмала по уравнению (3.1):

С = = 0,04648 г.

Подставляя найденные величины С и а в уравнение (3.5), рассчитывают АС исследуемого солода:

АС = ед/г.

Влажность солода 38 %. Амилолитическая активность на абсолютно сухое вещество солода (29,08 ·100)/62 = 46,9 ед/г, или в международных единицах 46,9 · 103 = 4831 ед /г.

 

Задание 3 Сделать выводы по проделанной работе, ответить на контрольные вопросы.

Вопросы для контроля:

1 Назовите требования, предъявляемые к ферментным препаратам, используемым в спиртовой промышленности.

2 Перечислите требования, предъявляемым к качеству свежепропросшего солода, используемого в спиртовой промышленности.

3 В чем выражается амилолитическая активность ферментного препарата?

4 Расскажите методику определения амилолитической активности фотоэлектроколориметрическим методом. На чем основано применение данного метода?

 

 

Лабораторная работа №4