Тема № 2. Дослідження аеробного окиснення глюкози та альтернативних шляхів обміну моносахаридів.

Мета заняття: Знати роль мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу для аеробного перетворення глюкози. Засвоїти значення та послідовність ферментативних реакцій пентозофосфатного шляху окиснення глюкози. Оволодіти особливостями метаболічних шляхів перетворення фруктози і галактози в організмі людини.

Актуальність теми: Обмін вуглеводів охоплює весь складний процес перетворення вуглеводів від поступлення їх в організм, травлення та всмоктування в клітині, до утворення кінцевих продуктів – СО₂ і Н₂О.

Етапи катаболізму вуглеводів у клітині включають утворення, в аеробних умовах, пірувату який у вигляді ацетильної групи інтегрується в КоА з утворенням ацетил – КоА, що окиснюється до СО₂ і Н₂О в циклі трикарбонових кислот(циклі Кребса).

Серед альтернативних шляхів обміну глюкози важливе місце належить пентозофосфатному (фосфоглюконатному) шляху, важливим продуктом якого є НАДФН, що постачає відновні еквіваленти для реакцій синтезу жирних кислот, стероїдів; та рибозо-5-фосфату необхідного для синтезу нуклеїнових кислот.

Одночасно з глюкозою в клітині катаболізується фруктоза та галактоза, порушення метаболізму яких зумовлюється ензимопатіями (фруктозо-1-фосфатальдолази та галактозо-1-фосфат-уридилтрансферази).

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати механізми перетворення моносахаридів до кінцевих продуктів із звільненням енергії в аеробних умовах.

Ø Аналізувати структурно-функціональні особливості мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу.

Ø Пояснювати послідовність ферментативних реакцій та значення пентозофосфатного шляху окиснення глюкози.

Ø Аналізувати метаболічні шляхи перетворення фруктози і галактози в організмі людини.

Теоретичні питання

1. Етапи аеробного окиснення глюкози.

2. Окиснювальне декарбоксилування піровиноградної кислоти:

• будова мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу;
• особливості функціонування піруватдегідрогеназного комплексу;
• механізм реакції окисного декарбоксилування пірувату;
• роль вітамінів та коферментів у перетворенні пірувату в ацетил-КоА.

3. Енергетична цінність аеробного окиснення глюкози.

4. Пентозофосфатний шлях (ПФШ) окиснення глюкози:

• схема реакцій окиснювальної та неокиснювальної стадій ПФШ;
• роль ферментів та коферментів у перебігу реакцій ПФШ;
• біологічне значення ПФШ.
• порушення ПФШ в еритроцитах; ензимопатії глюкозо-6-фосфатдегідрогенази;

5. Ферментативні реакції перетворення фруктози в організмі людини. Спадкові ензимопатії обміну фруктози.

6. Ферментативні реакції перетворення галактози в організмі людини. Спадкові ензимопатії обміну галактози.

7. Малат-аспартатний шлях переносу гліколітичного НАДН2 в мітохондрії.

8. Гліцеролфосфатний човниковий механізм переносу гліколітичного НАДН₂ в мітохондрії.

 

Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення піровиноградної кислоти (ПВК) в сечі колориметричним методом.

Піровиноградна кислота – один з центральних метаболітів вуглеводного обміну. Визначення її кількості в плазмі крові та сечі широко використовується з діагностичною метою в клінічній практиці.

Принцип методу. Піровиноградна кислота (ПВК) з 2,4-динітрофенілгідразином (2,4 ДНФГ) в лужному середовищі утворює 2,4-динітрофенілгідразони піровиноградної кислоти коричнево-червоного забарвлення, інтенсивність якого пропорційна концентрації ПВК і визначається колориметрично.

 

Матеріальне забезпечення:сеча, стандартний розчин пірувату (ПВК) – 625мг в100 мл води,

 

0,1 % розчин 2,4- динітрофенілгідразину в 2 н розчині соляної кислоти, 12 % розчин гідроксиду натрію, дистильована вода, штатив з пробірками, піпетки, ФЕК.

Хід роботи. Беруть 2 пробірки, в одну наливають 0,1мл сечі, в другу – 0,1мл розчину ПВК, а потім в обидві пробірки додають по 0,9 мл дистильованої води. Після цього вносять по 0,5мл 0,1 % р-ну 2,4- динітрофенілгідразину, змішують і на 20 хв ставлять в темне місце. Пізніше додають по 1 мл 12 % розчину гідроксиду натрію і через 10 хв колориметрують на ФЕКу проти контролю (води) при синьому світлофільтрі (l = 380 нм).

 

Розрахунок: концентрацію ПВК вираховують за формулою:

С_СТАНД. · А_ДОСЛ. · V

С_ДОСЛ. =

А_СТАНД. · а

де:

С _ДОСЛ – концентрація ПВК у сечі (мг/добу);

С_СТАНД – концентрація стандартного розчину ПВК;

А_ДОСЛ – оптична густина досліджуваної проби;

А_СТАНД – оптична густина стандарту;

V – добова кількість сечі;

а – 0,1 мл сечі, взятої для аналізу.

Порівняти отриманий результат з нормативними величинами. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У крові здорової людини міститься 45-115 мкмоль/л ПВК, з сечею за добу виділяється 15-25 мг ПВК. Вміст ПВК у крові (разом з молочною кислотою) підвищується при посиленій м’язовій праці, а також при деяких патологічних станах, що супроводжується судомами (тетанія, епілепсія, правець). Збільшується виділення ПВК з сечею при В₁- вітамінній недостатності, серцевій недостатності, токсикозах, захворюваннях печінки, інсулінзалежному цукровому діабеті, діабетичному кетоацидозі, дихальному алкалозі, уремії, гепатоцеребральній дистрофії, гіперфункції гіпофізарно-адреналової і симпатико-адреналової систем, а також після введення камфори, стрихніну, адреналіну. До збільшення ПВК призводять токсична дія ацетилсаліцилової кислоти, отруєння ртуттю, миш’яком, сурмою.

Вміст ПВК різко підвищується у спинномозковій рідині при травматичних захворюваннях ЦНС, запальних процесах: менінгіті, абсцесі мозку. Під впливом наркозу рівень ПВК у крові дещо знижується. Всі фактори, які зумовлюють збільшення концентрації ПВК, як правило, призводять до зростання рівня молочної кислоти.

Таким чином, основною причиною нагромадження в крові піровиноградної та молочної кислот є порушення їх наступного ферментативного перетворення у звичайні продукти розпаду внаслідок різних причин.