Дослід 3. Кількісне визначення білка в досліджуваному розчині шляхом вимірювання оптичної густини колориметричним методом (Біуретова реакція).

Принцип методу. Біуретова реакція – характерна реакція на сполуки, що містять в своєму складі не менше двох пептидних зв’язків. Такі сполуки в лужному середовищі утворюють з купруму сульфатом (мідним купоросом) комплекс, забарвлений у рожево-фіолетовий колір. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв’язки в енольній формі. Біуретова реакція служить доказом наявності пептидних зв’язків у білках та пептидах.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, калій-натрій виннокислий, міді сульфат, 0,9 % розчин NаCl, 10 % розчин NaOH, мірні пробірки, піпетки на 1, 2 і 10 мл, ФЕК, біуретовий реактив: 0,15 г CuSO₄ · 5 Н₂О; 0,6 г калію-натрію виннокислого і 50 мл Н₂О. Суміш перемішують і додають 30 мл 10 % розчину NаОН, 0,1 г калію йодиду і доводять водою до об’єму 100 мл (зберігають у холодильнику в запарафінованому посуді).

Хід роботи: У першу пробірку вносять 0,1 мл 0,9 % розчину NаCl (контроль), у другу – 0,1 мл стандартного розчину білка (50 г/л), у третю, четверту і п’яту пробірки – по 0,1 мл досліджуваного розчину білка (задачі). У кожну пробірку додають по 5 мл біуретового реактиву, перемішують і через 30 хв визначають екстинкцію за допомогою фотоелектроколориметра в кюветах товщиною 10 мм при синьому світлофільтрі (440 нм) проти контрольного розчину. Поява фіолетового забарвлення (біуретова реакція) свідчить про наявність у розчині білка чи поліпептидів. Інтенсивність забарвлення змінюється залежно від концентрації білка в розчині.

Розрахунок проводять за формулою:

Х= (С ´ А_і) / А_ст, де:

Х – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л;

С – концентрація речовин у стандартному розчині;

А_і – оптична густина досліджуваного розчину;

А_ст – оптична густина стандартного розчину білка.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок. Вказати на властивості білків утворювати в лужному середовищі з CuSO₄ комплекс рожево-фіолетового забарвлення.

Кількісно загальний білок можна визначати в сироватці або плазмі крові за допомогою тестового набору реактивів напівавтоматичним біохімічним аналізатором „Stat Faх 1904 plus”.

Клініко-діагностичне значення. Для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі найчастіше застосовують фотоколориметричні та спектрофотометричні методи, у деяких випадках застосовують фотонефелометричні методи, а також визначення білка за вмістом загального нітрогену (азотометрія).

У клініко-біохімічних лабораторіях для встановлення діагнозу захворювання проводять визначення концентрації білків у біологічних рідинах організму (крові, сечі, спинномозковій рідині, ексудатах). У нормі вміст загального білка у сироватці крові дорівнює у дорослих 65-85 г/л (6,5-8,5 г %), у дітей до 6 років 56-85 г/л (5,6-8,5 г %).

Колориметричні методи визначення кількості білка базуються на „кольорових” реакціях на функціональні групи білків: біуретова реакція; мікрометод визначення кількості білка за допомогою реактива Бенедикта; метод Лоурі; метод Лоурі в модифікації Святкіна (метод використовують для визначення вмісту білка в препаратах з підвищеним вмістом ліпо- і глікопротеїнів); метод Флореса.

Ультраспектрофотометричний метод визначення кількості білка базується на здатності ароматичних радикалів тирозину, триптофану і меншою мірою – фенілаланіну білка поглинати ультрафіолетове світло з максимумом поглинання при 280 нм.

Визначення вмісту білка сироватки крові рефрактометричним методом, основаним на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення. Величина показника заломлення сироватки крові залежить, головним чином, від вмісту в ній білка. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри.