Дослід 1. Виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація).

Принцип методу. Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях відбуваються реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилування. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, а компоненти дихального ланцюга локалізовані на внутрішній мембрані мітохондрій.

Для виділення мітохондрій м’язову тканину розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим наконечником, додаючи розчин сахарози. Виділення мітохондрій з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Швидкість осадження клітинних компонентів під дією відцентрової сили залежить від їх маси, розміру, а також часу центрифугування.

Матеріальне забезпечення: свіжі м’язи кроля; розчин № 1 – середовище для виділення мітохондрій (0,25 М розчин сахарози і 0,01 М розчин етилендіамінтетраацетатної кислоти (ЕДТА – для зв’язування кальцію, рН = 7,6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мітохондрій (0,25 М розчин сахарози в 0,02 М розчині трис-буфера з рН = 7,5). Всі розчини охолоджують до + 2^оС.

Хід роботи. Тканину м’язівочищають від жиру, подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 40 хв. при швидкості обертання – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі + 1-2^оС. Гомогенат звільняють від ядер та уламків клітинних мембран шляхом центрифугування впродовж 6 хв. при 700 об/хв. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують протягом 10 хв при 7000 об/хв.

Після видалення надосадової рідини отримують осад мітохондрій. Для очищення мітохондрій, додають вихідну кількість розчину № 1, осад ресуспендують, а потім проводять повторне осадження мітохондрій протягом 10 хв при 7000 об/хв. Осад мітохондрій ресуспендують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка.

Отриману суспензію мітохондрій використовують для проведення дослідів 2 – 4, а також для дослідження процесів тканинного дихання та окисного фосфорилування.

 

Дослід 2. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО₂ та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується виділенням СО₂. Як джерело ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО₂ не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (бурштинової кислоти).

Для зв’язування СО₂, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)₂. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО₂ визначають за виділенням бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сульфатної кислоти.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин Са(ОН)₂, суспензія мітохондрій, 0,1 М розчин H₂SO₄, термостат, штатив із пробірками, піпетки

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл	2,0	2,0	2,0
Розчин пірувату натрію, мл	0,5	0,5	0,5
Малонова кислота, мл	–	–	0,5
Фізіологічний розчин, мл	0,5	0,5	–
Розчин Са(ОН)2, мл	0,5	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій, мл	–	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння,мл	0,5	–	–
Інкубація в термостаті: 15 хв при температурі 37^оС
0,1 М розчин H2SO4, мл	1,0	1,0	1,0
Результати: виділення бульбашок СО2

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв при 37^оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0 мл 0,1 М розчину H₂SO₄ і спостерігають за вивільненням бульбашок СО₂

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.