Тема № 8. Дослідження перетворень амінокислот (трансамінування, дезамінування, декарбоксилування), біосинтезу глутатіону та креатину.

Мета заняття: Вивчити загальні шляхи перетворення амінокислот, оволодіти методами ідентифікації їх метаболітів. Вміти інтерпретувати отримані показники.

Актуальність теми: Обмін білків є центральною ланкою всіх біохімічних процесів, знання і розуміння загальних шляхів перетворень амінокислот, їх метаболітів та визначення активності ферментів, що беруть участь у цих перетворення є критеріями для оцінки обміну білків.

Конкретні завдання:

Ø Визначати активність амінотрансфераз у сироватці крові динітрофенілгідразиновим методом;

Ø Оволодіти методом кількісного визначення креатиніну в сироватці крові;

Ø Давати оцінку проведеним дослідженням і робити висновки про можливість їхнього використання у клінічній практиці.

Теоретичні питання

1. Шляхи утворення та підтримання пулу вільних амінокислот в організмі людини.Загальні шляхи перетворення вільних амінокислот.

2. Трансамінування амінокислот, субстрати для реакцій транс амінування. Механізм реакції трансамінування. Трансамінази. Локалізація трансаміназ в органах і тканинах. Клініко-діагностичне значення визначення активності трансаміназ.

3. Типи реакцій дезамінування амінокислот і їх кінцеві продукти. Механізм окиснювального дезамінування амінокислот. Оксидази L- і D-амінокислот. Їх ферментативна активність, специфічність дії.

4. Декарбоксилування амінокислот. Декарбоксилази. Утворення біогенних амінів (g-аміномасляна кислота, гістамін, серотонін, дофамін). Декарбоксилування амінокислот у процесі гниття білків у кишківнику. Окиснення біогенних амінів.

5. Глутатіон, будова та роль в обміні органічних пероксидів.

6. Утворення креатину та креатиніну, клініко-біохімічне значення порушень їхнього обміну.

 

Практична робота

Дослід 1. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ) уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля.

Принцип методу. У результаті реакції трансамінування під дією АлАТ утворюються піруват і глутамат. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється гідразон піровиноградної кислоти червоно-бурого забарвлення, інтенсивність якого прямопропорційна кількості утвореної піровиноградної кислоти і є показником активності АлАТ.

Матеріальне забезпечення: 0,4 М розчин NаОН, субстратний розчин (29,2 мг α-кетоглутарової кислоти і 1,78 мг D,L-аланіну розчиняють в 1 М NаОН до отримання рН 7,4, розчин переливають у мірну колбу на 100 мл і доводять 0,1 М фосфатним буфером до мітки). 0,1% розчин 2,4-динітрофенілгідразину, фотоелектроколориметр, термостат або водяна баня, холодильник, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. А) Кількісне визначення піровиноградної кислоти:

У дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл свіжорозмороженого субстратного розчину і ставлять у термостат при температурі 37⁰С на 5 хв. Потім у дослідну пробірку додають 0,1 мл досліджуваної сироватки, а в контрольну – 0,1 мл води і обидві пробірки ставлять в термостат при 37⁰С на 30 хв. Після інкубації пробірки виймають та в обидві додають по 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину, перемішують і витримують 20 хв при кімнатній температурі. Потім додають в обидві пробірки по 5 мл 0,4 М NaOН, перемішують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі при зеленому світлофільтрі (λ = 500-560 нм) у кюветі з товщиною шару 10 мм проти контрольної проби.

Кількість утвореної піровиноградної кислоти (у мкг) знаходять за калібрувальним графіком або за формулою І:

А

Х = (I)

0,09

де: А – визначена оптична густина.

 

В) Активність АлАТ вираховують за формулою ІІ:

де: Х – кількість піровиноградної кислоти, знайденої за калібрувальним графіком або за формулою І, мкг;

2 – коефіцієнт перерахунку на 1 год інкубації;

10 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки;

88 – маса 1 мкмоль піровиноградної кислоти.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Активність АсАТ у крові зростає через 4-6 год. після інфаркту міокарда і звичайно повертається до норми на 3-7 день. При стенокардії АсАТ залишається в нормі. Зниження нормальних показників амінотрансфераз у плазмі може бути при недостатності вітаміну В₆, а також при нирковій недостатності. Найвища активність АлАТ характерна для захворювань печінки – особливо в інкубаційному періоді інфекційного гепатиту.

Зростання активності ферментів у сироватці крові викликають некроз печінки або їх пошкодження будь-якої етіології, включаючи холестатичну і обструктивну жовтяницю, хронічні гепатити, алкогольний гепатит (АсАТ зазвичай більше АлАТ); вірусні і хронічні гепатити (АлАТ > АсАТ), метастази в печінку і гепатома; інфекційний мононуклеоз; некроз, травма, запальні захворювання серцевого або скелетного м’язу; після гострого інфаркту міокарда АсАТ > АлАТ; тяжке фізичне навантаження, серцева недостатність, тяжкі опіки, тепловий удар, гіпотиреоідизм, молочнокислий ацидоз та ін.

Нормальні значення або незначне підвищення спостерігається при цирозі печінки, неврологічних захворюваннях, церебральному інфаркті, гострому панкреатиті, гемофілії, порушенні процесів всмоктування в кишківнику, ожирінні та ін.

Діагностично важливим є одночасне визначення активності АлАТ і АсАТ та розрахунок коефіцієнта де Рітіса – АсАТ/АлАТ, який в нормі дорівнює приблизно 1,3. При інфекційному гепатиті він нижчий норми, при інфаркті міокарда – вищий норми.

Нормативні величини: для АлАТ – 28-190 нмоль/(с·л)

[0,1-0,68 мкмоль/(год.мл)] при 37 ^оС або 11,4 МО/л.

 

Дослід 2. Уніфікований метод визначення креатиніну за кольоровою реакцією Яффе (метод Поппера і співавторів)