Тема № 4. Дослідження механізмів метаболічної та гормональної регуляції обміну вуглеводів. Цукровий діабет.

Мета заняття: Знати роль гормонів у регуляції та підтриманні постійного рівня глюкози в крові. Засвоїти особливості порушень обміну вуглеводів, жирів, білків за цукрового діабету.

Актуальність теми: Концентрація глюкози в крові залежить від рівноваги між надходженням її в кров і споживанням тканинами. Оскільки виведення глюкози з організму в нормі є досить незначне, то підтримка постійності її концентрації у відносно вузьких межах за значних коливань надходження з їжею забезпечується процесами обміну в тканинах. Система регуляторних механізмів включає гормони інсулін, глюкагон, адреналін, глюкокортикоїди, а також взаємодії між тканинами: печінкою, м’язами, мозком та ін.

Конкретні завдання:

Ø Аналізувати основні джерела та шляхи використання глюкози крові.

Ø Пояснювати роль гормонів у підтримці постійного рівня глюкози в крові.

Ø Пояснювати порушення метаболізму вуглеводів за цукрового діабету.

Теоретичні питання

1. Біохімічні процеси, що забезпечують сталий рівень глюкози в крові. Роль різних шляхів обміну вуглеводів у регуляції рівня глюкози в крові.

2. Роль печінки в обміні вуглеводів.

3. Ендокринна регуляція обміну вуглеводів:

• інсулін, будова, механізм дії, роль в обміні вуглеводів;
• адреналін та глюкагон, механізми їх регулюючої дії на обмін вуглеводів;
• глюкокортикоїди, їх вплив на обмін вуглеводів;

4. Характеристика гіпер-, гіпоглікемії та глюкозурії.

5. Інсулінзалежна та інсуліннезалежна форми цукрового діабету. Біохімічні критерії цукрового діабету.

6. Характеристика біохімічних порушень за цукрового діабету.

7. Біохімічні тести для оцінки цукрового діабету (глюкозотолерантний тест, цукор в крові та сечі, кетонові тіла в крові та сечі, білок в сечі, глікозильований гемоглобін, С -пептид).

 

Практична робота

Дослід 1. Кількісне визначення цукру в крові орто-толуїдиновим методом (за Гульманом).

Принцип методу. Глюкоза при нагріванні з орто-толуїдином у розчині оцтової кислоти утворює сполуку синьо-зеленого забарвлення, інтенсивність якого є прямопропорційною до концентрації глюкози.

Матеріальне забезпечення: кров, 3 % розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАК), орто-толуїдиновий реактив, стандартний розчин глюкози (4 ммоль/л, 720 мг глюкози розчинити в 1 л дистильованої води), дистильована вода, штатив з пробірками, піпетки, мікропіпетка на 0,1 мл, центрифуга, центрифужні пробірки, ФЕК, водяна баня (100⁰ С).

Хід роботи. У дві центрифужні пробірки наливають по 0,9 мл 3 % розчину ТХАК. В одну з них вносять 0,1 мл крові, а в другу – 0,1 мл стандартного розчину глюкози. Вміст пробірок перемішують і центрифугують при 3000 об/хв протягом 10 хв. З кожної пробірки відбирають по 0,5 мл надосадової рідини та додають по 4,5 мл орто-толуїдинового реактиву. Поміщають пробірки в водяну баню на 8 хв. Потім їх виймають з водяної бані та охолоджують до кімнатної температури. Після цього на ФЕКу визначають оптичну густину проб у кюветах на 10 мм проти води при довжині хвилі 630 нм, використовуючи червоний світлофільтр.

Розрахунок. Вміст глюкози визначають за формулою:

С_СТАНД. · А_ДОСЛ.

С =

А_СТАНД.

де: С – концентрація глюкози в крові, ммоль/л;

С_СТАНД. – концентрація стандартного розчину глюкози;

А_{ДОСЛіду} – оптична густина досліджуваної проби;

А_СТанд. – оптична густина стандартного р-ну глюкози.

Порівняти з нормою отриманий результат. Зробити висновок.

Дослід 2. Визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом.

Принцип методу. Окиснення глюкози киснем повітря під дією глюкозооксидази з утворенням гідрогену пероксиду, який за присутності фенолу з 4-аміно-феназоном (4-аміноантипірином) утворює забарвлену сполуку.

Матеріальне забезпечення: глюкозооксидаза (активність 60 000 – 120 000 од/г); пероксидаза з кінського хрону (активність 11 000 од/мг); фенол; 4-аміно-феназон; b-Д-Глюкоза; фосфатний буфер 0,1 М рН 7,0; робочий реактив (150 мг/л глюкозооксидази, 1,1 мг/л пероксидази, 1,034 г фенолу, 0,148 г 4-аміно-феназону, довести фосфатним буфером до 1 л, стабільний протягом 1 міс в посудині з темного скла при температурі 4°С); 0,2 % розчин бензойної кислоти (2 г бензойної кислоти розчиняють у 800 мл дистильованої води під час нагрівання, після охолодження об’єм розчину доводять у мірній колбі на 1000 мл до позначки дистильованою водою, фільтрують); основний калібрувальний розчин глюкози 27,75 ммоль/л (500 мг висушеної до сталої маси D-глюкози розчиняють у мірній колбі на 100 мл в невеликій кількості 0,2 % розчину бензойної кислоти); калібрувальний розчин глюкози 5,55 ммоль/л (100 мг/100 мл); стандарт (основний калібрувальний розчин глюкози розводять у 5 разів 0,2 % розчином бензойної кислоти); розчин хлоридної кислоти – 0,33 ммоль/л.

Хід роботи. Послідовність досліду наведено у таблиці.

 

Послідовність визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом
Інгредієнти	Дослідна проба, мл	Стандартна проба, мл	Контрольна проба, мл
Сироватка, плазма	0,02	-	-
Стандарт	-	0,02	-
Робочі реактиви

 

Вміст пробірок перемішують, інкубують за кімнатної температури 30 – 60 хв. Колориметрують за довжини хвилі 490 – 540 нм проти контрольної проби. Результати обчислюють за формулою:

С_досл. = С_СТАНД. ´ А_{ДОСЛІДУ},

А_СТАНД.

де С_досл. – концентрація глюкози в дослідній пробі, ммоль/л;

С_СТАНД. – концентрація глюкози в стандартній пробі, ммоль/л;

А_{ДОСЛІДУ} – оптична густина (екстинкція) дослідної проби;

А_СТАНД. – оптична густина стандартної проби.

Порівняти з нормою отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Фізіологічні гіперглікемії спостерігають при емоційних стресах, споживанні великої кількості вуглеводів з їжею. Патологічні гіперглікемії найчастіше пов’язані з захворюваннями ендокринної системи, спостерігаються при цукровому діабеті, пухлинах кори наднирників та гіпофізу, важких розладах функції печінки, гіперфункції щитовидної залози, органічних ураженнях нервової системи.

Гіпоглікемія виникає при аденомі острівцевого апарату підшлункової залози внаслідок підвищеної продукції інсуліну b-клітинами, недостатній функції щитовидної залози, наднирників, гіпофізу. Крім того, гіпоглікемія може бути викликана голодуванням, важкою фізичною працею, передозуванням інсуліну при лікуванні, порушенням всмоктування вуглеводів, захворюванням нирок, які супроводжуються зниженням ниркового порогу для глюкози.

Особливе значення має дослідження цукрового навантаження на рівень цукру в крові. Метод цукрового навантаження дозволяє виявити приховані форми діабету, порушення глікогенутворювальної функції печінки та вплив інсуліну на обмін вуглеводів, також має особливе значення для диференціації панкреатичної та ренальної глюкозурії.

Суттєве клініко-діагностичне значення має діагностичний тест на кетонові тіла в крові та сечі. Наприклад, кетонурія при ІЗЦД І типу вказує на загрозу кетоацидозу. Відсутність кетонемії або кетонурії під час коматозних станів дозволяє виключити кетоацедозну кому, як причину порушення. Необхідно мати на увазі, що й інші метаболічні стани: голодування, алкогольний кетоацидоз, вживання їжі багатої на жири та гарячка можуть призвести до утворення кетонових сполук та появи кетонурії (кетонемії).