Модуль 2. Загальні закономірності метаболізму

Вступ

Біологічна хімія належить до фундаментальних медичних дисциплін. Знання біохімічних процесів, що відбуваються на різних рівнях організації – клітинному, органному, тканинному та цілому організмі – необхідні студентам-медикам як для розуміння метаболічних процесів обміну речовин, енергії, перебігу реакцій розпаду та синтезу, передачі спадкової інформації, процесів, що забезпечують перебіг фізіологічних функцій, так і для інтерпретації біохімічних показників з діагностичною або прогностичною метою у клініці.

Згідно програми з біологічної та біоорганічної хімії, що розроблена на засадах Європейської кредитно-трансферної системи (ECTS) для студентів вищих навчальних закладів освіти України ІІІ – IV рівнів акредитації, біологічна хімія включає чотири модулі. У кожен модуль входить певна кількість змістовних модулів і навчальних годин: на лекційний курс відведено 40 год.; практичні заняття – 120 год.; самостійну роботу студентів – 50 год., що відповідає 7 кредитам ECTS.

На кожному практичному занятті студенти мають засвоїти визначений програмою навчальний матеріал, провести дослідження різних речовин та інтерпретувати їх роль. До кожного змістовного модуля студентам пропонуються теми для індивідуальної самостійної роботи та тести.

Суттєва увага при вивченні біологічної хімії приділяється клінічним аспектам – спадковим та набутим порушенням обміну речовин, ензимопатіям, питанням застосування ензимів як фармпрепаратів, а також патохімічним процесам, які відбуваються при розвитку та перебігу цукрового діабету, атеросклерозу, ревматизму, інфаркту міокарда, захворювань травної системи тощо.

Для покращення засвоєння навчального матеріалу студенти мають використовувати сучасні підручники та посібники, що підготовлені провідними спеціалістами України та працівниками кафедри біохімії Львівського національного медичного університету.

Кінцеві цілі при вивченні навчальної дисципліни „Біологічна та біоорганічна хімія” пов’язані з тим, що студент у своїй майбутній професійній діяльності повинен вміти:

Ø Аналізувати відповідність структури біоорганічних сполук фізіологічним функціям, які вони виконують в організмі людини.

Ø Інтерпретувати особливості фізіологічного стану організму та розвитку патологічних процесів на основі лабораторних досліджень.

Ø Аналізувати реакційну здатність вуглеводів, ліпідів, амінокислот, що забезпечує їх функціональні властивості та метаболічні перетворення в організмі.

Ø Інтерпретувати особливості будови та перетворень в організмі біоорганічних сполук як основи їх фармакологічної дії в якості лікарських засобів.

Ø Інтерпретувати біохімічні механізми виникнення патологічних процесів в організмі людини та принципи їх корекції.

Ø Пояснювати основні механізми біохімічної дії та принципи спрямованого застосування різних класів фармакологічних засобів.

Ø Пояснювати біохімічні та молекулярні основи фізіологічних функцій клітин, органів і систем організму людини.

Ø Аналізувати функціонування ферментативних процесів, що відбуваються в мембранах і органелах для розуміння інтеграції обміну речовин.

Ø Класифікувати результати біохімічних досліджень та зміни біохімічних і ферментативних показників, що застосовуються для діагностики найпоширеніших хвороб людини.

Ø Інтерпретувати значення біохімічних процесів обміну речовин та його регуляції в забезпеченні функціонування органів, систем та цілісного організму людини.

Ø Підготовка методичних вказівок базується на засадах програми з навчальної дисципліни „Біологічна та біоорганічна хімія” (Київ, 2005) з врахуванням особливостей викладання на кафедрі біохімії ЛНМУ імені Данила Галицького.

 

З часу переходу викладання предмету “Біологічна та біоорганічна хімія” згідно вимог кредитно-трансферної системи (ECTS) минуло понад п’ять років. За цей період визначені певні позитивні та негативні аспекти викладання за цією системою. Враховуючи отриманий досвід колектив кафедри біохімії ЛНМУ імені Данила Галицького оновив методичні розробки з метою підвищення доступності та якості знань, що набувають студенти медичного факультету під час практичних занять.

ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ ПРИ РОБОТІ СТУДЕНТІВ У НАВЧАЛЬНІЙ ХІМІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ

1. Перебуваючи в хімічній лабораторії, необхідно суворо дотримуватись загальних правил техніки безпеки, пам’ятаючи, що будь - яке порушення може призвести до нещасного випадку.

2. У хімічній лабораторії працювати тільки в медичних халатах та шапочках. Довге волосся має бути акуратно підібране.

3. На робочому місці залишати тільки необхідні речі (книгу, зошити, ручки), всі інші речі (портфелі, сумки, одяг) зберігати в спеціально відведеному для цього місці, одяг у гардеробі.

4. Кожен студент повинен працювати за закріпленим за ним місцем, перехід на інше робоче місце без дозволу викладача не допускається.

5. Категорично забороняється виконувати в лабораторії роботи, не пов’язані із виконанням навчального практикуму.

6. Реактиви після їх використання необхідно ставити на відведене місце.

7. Роботи з концентрованими кислотами, лугами слід проводити обережно, під витяжною шафою, щоб виключити можливість їх потрапляння в очі, а також появи опіків і пошкодження одягу.

8. Бути обережним при роботі з електроприладами. Працювати тільки із заземленим обладнанням.

9. При запалюванні газу, кран пальника відкривати поступово.

10. Для уникнення нещасних випадків не працювати з леткими та легкозаймистими речовинами поблизу запаленого пальника.

11. Користуватись горючими і токсичними речовинами (галогени, концентровані кислоти, луги, сірководень і т.д.), а також проводити досліди, які супроводжуються виділенням шкідливих парів, газів, дозволяється тільки у витяжній шафі.

12. При нагріванні речовин у пробірці - не направляти її отвір у бік товариша, який працює, або до себе.

13. Не можна залишати в лабораторії без нагляду включені фотоелектроколориметри, водяні бані, газові пальники, центрифуги тощо.

14. У випадку пожежі негайно погасити найближчі пальники і гасити вогонь використовуючи вогнегасник, покривало, пісок.

15. При опіках: а) сильними лугами – необхідно промити уражені ділянки тіла водою і накласти компрес, змочений 1% розчином оцтової кислоти; б) сильними кислотами – необхідно промити уражені ділянки тіла водою і накласти компрес, змочений 1% розчином соди; в) фенолом – необхідно розтерти побілілу від опіку ділянку до нормального стану шкіри, а потім промити водою і накласти пов’язку з гліцерином.

16. У разі потрапляння кислоти або лугу в очі необхідно промити їх великою кількістю води, а потім 2% розчином соди або борної кислоти.

17. Не виливати в раковину вміст пробірок з концентрованими кислотами та лугами.

18. Не кидати папір, сірники, побитий посуд в водостічну раковину, для цього користуватись ящиками для сміття.

19. Після закінчення роботи привести в порядок своє робоче місце, протерти полиці і стіл вологою ганчіркою, поставити посуд з реактивами на відведене місце виключити воду та газ.

20. Під час заняття мобільні телефони повинні бути виключеними.

 

 

Модуль 2. Загальні закономірності метаболізму.

 

Змістовий модуль № 5. Вступ у біохімію. Біохімічні компоненти клітин.

 

Тема № 1. Предмет і завдання біохімії. Мета і методи проведення біохімічних досліджень; їх обґрунтування і клініко-діагностичне значення.

 

Мета заняття: Ознайомити студентів з предметом і завданнями біологічної хімії та її практичним використанням, методами біологічних досліджень, які використовуються в клінічній практиці.

Оволодіти деякими фізико-хімічними методами досліджень біологічно важливих речовин, а також ознайомитися з апаратурою, що використовується в біохімії. Отримання результатів біохімічних досліджень необхідно для пояснення механізмів функціонування органів і тканин у нормі та при патології, для постановки діагнозу, моніторингу перебігу захворювання та ефективності лікування. Знати фактори, дія яких призводить до похибки біохімічних досліджень.

Актуальність теми: Біохімія – це наука, яка вивчає хімічний склад живих організмів, будову, властивості, локалізацію та роль наявних у них сполук, шляхи їх виникнення і перетворення, а також притаманні живій клітині хімічні процеси, які в сукупності забезпечують обмін речовин й перетворення енергії.

Через біохімію лежить шлях до розв’язання основних питань природознавства і медицини, зокрема, проблеми синтезу білків, довголіття.

У біохімічних дослідженнях використовуються сучасні фізико-хімічні, фізичні та математичні методи. Біохімічні показники використовуються для діагностики, лікування та профілактики захворювань.

Конкретні завдання:

1. Знати етапи та закономірності становлення біохімії як фундаментальної медико-біологічної науки та навчальної дисципліни;

2. Знати принципи методів біохімічних досліджень функціонального стану організму людини в нормі та при патології;

3. Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану певних ланок обміну речовин;

4. Вміти визначати оптичну густину забарвлених розчинів при різних довжинах хвиль на фотоелектроколориметрі. Правильно інтерпретувати отримані результати.

 

Теоретичні питання

1. Предмет і завдання біохімії. Основні напрямки та розділи біохімії: статична, динамічна, функціональна біохімія, медична та клінічна біохімія.

2. Біохімія як фундаментальна медико-біологічна наука. Історія розвитку, наукові біохімічні школи, значення в системі вищої медичної освіти.

3. Внесок вчених кафедри біохімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького в розвиток біологічної хімії.

4. Хімічний склад живого організму. Біомолекули (білки, вуглеводи, ліпіди, нуклеїнові кислоти, гормони, вітаміни тощо), їх біохімічні функції. Характерні риси живої матерії: обмін речовин й енергії та їх зв’язок із зовнішнім середовищем.

5. Структурні елементи прокаріотичних та еукаріотичних клітин. Основні функції субклітинних органел, їх фракційне розділення методом ультрацентрифугування.

6. Принципи основних методів біохімічних досліджень:

• осадження речовин з розчину, висолювання білків;
• оптичні методи в біохімії (фотоелектроколориметрія, спектрометрія, спектрофотометрія, флюоресцентний аналіз);
• електрофорез (горизонтальний, диск-електрофорез, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез);
• хроматографія (афінна, іонообмінна, тонкошарова, газова, гель-хроматографія);
• полярографія;
• манометричний та радіоізотопний методи;
• імуноферментні методи;
• полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

7. Мета проведення біохімічних лабораторних досліджень і критерії оцінки використаних методів лабораторних досліджень.

8. Матеріал для лабораторних діагностичних досліджень, принципи забору та збереження матеріалу для лабораторних досліджень.

9. Характеристика помилок, що мають місце під час проведення лабораторних досліджень.

Емісійна фотометрія – грунтується на визначенні енергії, яка випромінюється досліджуваною речовиною в енергетично збудженому стані. До методів емісійної фотометрії відносять флюориметрію і полум’яну фотометрію.

Флюориметрія базується на ефекті флюоресценції, що дає енергетично збуджена досліджувана речовина під впливом короткохвильового опромінення.

Полум’янафотометрія полягає у використанні як енергетичного агента, що забезпечує стан збудження розчину досліджуваної речовини, полум’я газової горілки. Йони металів забарвлюють полум’я відповідно до характерних для них спектрів випромінювання. Щоб виділити випромінювання окремих йонів, застосовують спеціальні світлофільтри, після чого виконують всі необхідні вимірювання.

Явище холодного світіння деяких речовин, спричинене зміною електронного стану молекул або атомів, називається люмінесценцією.

Люмінесцентний аналіз, в основі якого лежить флюоресценція, набув широкого застосування. Вимірювання інтенсивності флюоресценції залежить від концентрації речовин, що дає змогу проводити кількісне визначення речовин на спеціальних приладах – флюориметрах. У ході цих досліджень як джерело збудження використовують ультрафіолетове випромінювання.

Електрофорез – розділення заряджених частинок в електричному полі. Різна молекулярна маса зарядів речовин визначає різну швидкість пересування, що дає змогу їх диференціювати. Швидкість руху йонів збільшується з посиленням електрофоретичного заряду, сили електричного поля, але зменшується зі збільшенням радіуса частинок, що рухаються, і збільшенням в’язкості середовища. На швидкість руху заряджених частинок впливає температура навколишнього середовища, з підвищенням якої наростає швидкість руху йонів.

Використовують такі методи електрофорезу: фронтальний, зональний, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез.

Фронтальний електрофорез – розділення речовин у гомогенному розчині без стабілізації зон розподілу. Зональні методи електрофорезу дають змогу отримувати стабільні зони розподілу й класифікуються залежно від роздільного середовища. Для цього типу електрофорезу як середовище використовують порошки та інші пористі матеріали (крохмаль, целюлоза, полівінілхлорид), гелі (крохмальний, агаровий, поліакриламідний), смуги паперу та інших волокнистих матеріалів.

Зональний електрофорез залежно від джерела живлення і камери поділяється на горизонтальний і вертикальний (диск-електрофорез).

Імуноелектрофорез належить до найчутливіших і найсучасніших методів імунологічного аналізу. За допомогою цього методу можна визначити кількість компонентів суміші, а також ідентифікувати ці компоненти за їхньою електрофоретичною рухливістю, імунологічною специфічністю, а іноді – за хімічною природою, а також виявити речовини, здатні давати реакцію преципітації з антитілами, тобто переважно білки і вуглеводи.

Метод імуноелектрофорезу дає змогу дуже точно встановити компоненти складних білкових сумішей за їх імунологічною специфічністю та електрофоретичною рухливістю.

Хроматографія.

Для розділення й кількісного визначення білків і амінокислот, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ліпідів та інших метаболітів використовують різні методи хроматографії.

Існує декілька різновидів хроматографічного методу аналізу. Найважливіші з них:

· адсорбційна хроматографія, що базується на різній здатності окремих сполук адсорбуватися на тих чи тих сорбентах;

· йонообмінна, що базується на різній здатності розділюваних речовин до йонного обміну з тим чи тим іонітом;

· розподільна, що грунтується на різній розчинності розділюваних речовин, у двох рідинах, що частково змішуються;

· дифузна, що грунтується на розділенні речовин за швидкістю дифузії всередину сорбента (гель-фільтраційна хроматографія, при якій розділення речовин грунтується на механічному явищі молекулярного просіювання);

· хроматографія за спорідненістю (афінна хроматографія) – високоспецифічний метод розділення різних сполук, що базується на використанні нерозчинних форм біологічно активних речовин, споріднених з розділюваними речовинами.

У ході газової хроматографії розділення суміші речовин здійснюють в атмосфері газу. Адсорбційну, йонообмінну, розподільну, дифузну хроматографію можна проводити в колонках і на площині (на папері і в тонких шарах).

Гель-фільтрація дає змогу розділяти речовини залежно від їх молекулярної маси й форми молекул. Цей метод базується на здатності молекул різних розмірів і форм дифундувати в гелі з різною швидкістю. Для гель-фільтрації найчастіше застосовують декстранові гелі, які отримали назву сефадексів.

Полярографічний метод грунтується на принципі визначення сили струму під час окисно-відновних реакцій на зовнішній поверхні робочого електроду. На момент проходження струму в процесі електровідновлення або електроокиснення на полярограмах з’являються ділянки з силою струму пропорційною концентрації реагентів. Зміна висоти полярограм дає уявлення про концентрацію речовини.

Завдяки дослідженню біологічних об’єктів полярографічним методом виявляють катіони, аніони, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та інші речовини.

Особливе місце займає полярографічний метод у дослідженні білків і ферментів: дає відомості про деякі функціональні групи білків (-SH, -NH₂, імідазольну групу), каталітичну активність ферментів тощо.

Використання манометричного і радіоізотопного методів дає змогу провести дослідження як на рівні клітини, так і на рівні цілого організму.

Імуноферментний аналіз (ІФА) – метод кількісного визначення речовин з дуже низькою концентрацією, що спричинюють утворення антитіл. Основою цього методу є реакція “ антиген – антитіло”, тобто, специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною.

Для кількісного аналізу застосовують переважно два види ІФА. Першим етапом здійснення аналізу виступає зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. Далі реалізується реакція конкурентного або непрямого типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують з іммобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решту суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже іммобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, що містять досліджувану речовину поміщають у лунки планшету для мікротитрування із сорбованими на стінках антитілами, здатними специфічно зв’язувати цю речовину, наприклад гормон. Одночасно до інкубаційної суміші додають невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат. Кон’югат і гормон, який визначають, конкурують між собою за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після реалізації зв’язування антигенів незв’язані молекули відмивають.

Для встановлення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і пофарбовані продукти ферментативної реакції виявляють фотометрично. Чим більше гормону в тестованій пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється з урахуванням калібрувальної кривої, побудованої за стандартними зразками з відомою концентрацією.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) – це високоспецифічний метод експрес–діагностики, що дозволяє множити певні нуклеотидні послідовності до утворення необмеженого числа копій генів в таких кількостях, які можна виявити методом молекулярної гібридизації за допомогою електрофорезу. ПЛР базується на багатократному повторюванні циклів синтезу (ампліфікації) специфічної ділянки ДНК–мішені з дезоксинуклеозидтрифосфатів у присутності термостабільної ДНК–полімерази, відповідного сольового буфера та олігонуклеотидних затравок–праймерів, що визначають кордони ампліфікованої ділянки ДНК-мішені. Для діагностики інфекційного захворювання підбираються системи праймерів, комплементарних специфічним для збудника ділянкам генів, які дозволяють ампліфікувати фрагмент, що має для кожної системи праймерів свою довжину.

 

Практична робота

Література

Основна:

1. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Медицина, 2010. – 360 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 7 – 40 с.

5. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Вінниця: Новакнига, 2009. – 24 – 33 с.

6. Клінічна біохімія. Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 11 – 28 с.

7. Клінічна біохімія. Лекції для студентів медичного, стоматологічного та фармацевтичного факультетів/ За ред. О.Я. Склярова. – Львів, 2004. – 294 с.

8. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 3 – 46.

 

Додаткова:

1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.

3. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. – Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. – 384 с.

4. Владика А. Особливості визначення загального білка сироватки крові // Клініко-лабораторна діагностика. – 1995. – № 3. – С. 10-12.

5. Клиническая биохимия: Учебное пособие для вузов / Бочков В.Н., Добровольский А.Б., Кушлинский Н.Е. и др. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 521 с.

6. Кучеренко М. Є., Бабенюк Ю. Д., Войціцький В. М. Сучасні методи біохімічних досліджень. – Київ: Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с.

7. Сув’язь поколінь. Фармацевтичний факультет Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького / Зіменковський Б.С., Калинюк Т.Г. та ін. – Львів: Наутілус, 2009. – с. 414-447.

 

 

Тема № 2. Дослідження будови та фізико-хімічних властивостей білків-ферментів. Засвоєння методів виявлення ферментів у біологічних об’єктах.

Мета заняття: Засвоїти принципи організації та загальні властивості ферментів. Оволодіти методом визначення активності амілази слини і на її прикладі вивчити вплив температури та рН середовища на активність ферментів.

Актуальність теми: Ферменти – це біологічні каталізатори білкової природи, які забезпечують прискорення і координацію численних метаболічних процесів в живих організмах. Існують тисячі ферментів, які каталізують окремі хімічні перетворення або групи споріднених реакцій. Ферменти розрізняються за своєю будовою, наявністю небілкових компонентів, локалізацією, різними фізико-хімічними та каталітичними властивостями. Активність ферментів може змінюватись в широких межах в залежності від численних внутрішніх та зовнішніх факторів.

Конкретні завдання:

Ø Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

Ø На основі розуміння фізико-хімічних властивостей білків-ферментів пояснювати залежність активності ферментів від рН середовища, температури та інших факторів.

Ø Аналізувати активність ферментів плазми крові залежно від їх внутрішньоклітинної та тканинної (органної) локалізації.

Ø Аналізувати методи виявлення активності ферментів з метою їх оптимального застосування в клініко-лабораторному аналізі.

Теоретичні питання

1. Ферменти: визначення; властивості ферментів як біологічних каталізаторів реакцій обміну речовин.

2. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: електрохімічні (поверхневий заряд молекули) властивості, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення.

3. Прості та складні білки-ферменти. Кофактори, коферменти та простетичні групи складних ферментів. Навести приклади. Роль іонів металів у функціонуванні ферментів.

4. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри, їх значення.

5. Рівні структурної організації ферментів. Мультиферментні комплекси, ферментативні ансамблі, поліфункціональні ферменти, їх переваги.

6. Номенклатура, класифікація, шифр ферментів. Типи реакцій, що каталізують окремі класи ферментів.

7. Властивості ферментів:

• залежність активності ферментів від рН середовища (пояснити і зобразити графічно);
• залежність активності ферментів від температури (пояcнити і зобразити графічно).

8. Специфічність ферментів. Види специфічності (абсолютна, відносна, стереоспецифічність). Навести приклади.

9. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів. Навести приклади.

10. Тканинна (органна) специфічність ферментів. Навести приклади.

11. Методи визначення ферментів у біологічних об’єктах (кров, слина, сеча, окремі тканини).

 

Практична робота

 

Дослід 1.Виявлення амілази в слині (реакція з йодом).

Принцип методу. Амілаза відноситься до класу гідролаз – ферментів, що каталізують розрив хімічних зв’язків з приєднанням молекули води. Амілаза слини каталізує гідроліз крохмалю (розрив глікозидних зв’язків) через стадію утворення декстринів до дисахариду мальтози, про що свідчить реакція на крохмаль з йодом та реакція Тромера на мальтозу. Крохмаль утворює з йодом синє забарвлення і не дає забарвлення в реакції Тромера, оскільки не містить вільних альдегідних груп. Мальтоза містить вільну альдегідну групу, а тому її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0,5 % розчин крохмалю, 0,1 % І₂ в КІ, 10 % розчин NaOH, 5 % розчин CuSO₄, дистильована вода, газовий пальник, пробірки, піпетки, штатив.

Хід роботи. Для одержання розведеної слини ротову порожнину злегка прополіскують водою, набирають нову порцію дистильованої води і прополіскують нею рот протягом 1-2 хв. Зібрану в пробірку рідину використовують для аналізу.

Щоб переконатись у тому, що крохмаль з йодом дає синє забарвлення, в пробірку вносять 10 крапель розчину крохмалю та додають 2 краплі розчину I₂ в KI. Спостерігають позитивну реакцію.

У штатив ставлять 10 пробірок і наливають у кожну по 2 мл дистильованої води та додають по одній краплі розчину І₂ в KI.

В окрему пробірку наливають 5 мл 0,5 % розчину крохмалю, додають 1 мл розведеної слини, вміст пробірки перемішують і спостерігають опалесценцію. З цієї пробірки кожних 60 секунд відбирають по 0,5 мл рідини і вносять по черзі в пробірки № 1, 2, 3 і т.д., що були заготовлені з розчином І₂ в KI. Якщо після першого перенесення в пробірці спостерігають фіолетове або червоне забарвлення, то інтервал між перенесенням скорочують до 30 секунд.

Якщо чергова проба не змінює жовтого кольору розчину йоду, гідроліз крохмалю вважається закінченим. Відзначають час. Спостерігають зникнення опалесценції розчину в процесі гідролізу. Через 10 хв проводять пробу Тромера.

Для проведення проби Тромера до вмісту пробірки з реактивною сумішшю додають рівний об’єм 10 % розчину NaOH і 5-7 крапель 5 % розчину CuSO₄. Вміст пробірки перемішують до зникнення помутніння. Верхню частину пробірки обережно нагрівають на відкритому вогні до кипіння, реакція Тромера повинна бути позитивною, що відзначають за появою жовто-червоного осаду.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Хід роботи.

Специфічність амілази: в пробірки № 1 і 2 поміщають по 1 мл розведеної в два рази слини. В пробірку № 1 додають 2 мл 1 %-го розчину крохмалю, в пробірку № 2 – 2 мл 1 %-го розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять в термостат при t=37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Тромера.

Специфічність сахарази дріжджів: в пробірки № 3 і 4 поміщають по 1 мл препарату сахарази дріжджів. В пробірку № 3 додають 2 мл 1 %-го розчину сахарози, в пробірку № 4 – 2 мл 1 %-го розчину крохмалю. Обидві пробірки ставлять в термостат при t = 37°C на 15 хв. Після закінчення інкубації в обох пробірках проводять реакцію Тромера.

Результати проведеного експерименту заносять в таблицю:

 

№ пробірки	Фермент	Субстрат	Реакція Тромера
	Амілаза	Крохмаль
	Амілаза	Сахароза
	Сахараза	Сахароза
	Сахараза	Крохмаль

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Амілаза синтезується переважно в слинних та підшлунковій залозах. Підвищення активності амілази в крові спостерігається при панкреатиті, перитоніті, тромбозі судин, внаслідок введення в організм ряду фізіологічно активних сполук, зокрема морфіну, кодеїну, кортикотропіну (АКТГ) та кортизолу.

Підвищення активності амілази слинних залоз спостерігається при стоматиті, невралгії лицевого нерва, нирковій недостатності, паркінсонізмі. Зниження активності амілази крові спостерігається при психічних захворюваннях, анацидних порушеннях. Зниження вмісту амілази в слині має місце при гіпосалівації, запаленні слинних залоз, тощо.

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С.86-137.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С.66-107.

3. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С.51-66.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.47-62.

5. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – С.11-26.

 

Додаткова:

1. Клінічна біохімія. Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 431 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320с.

3. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

Тема № 3. Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

 

Мета заняття: На прикладі пептидаз панкреатину і амілази слини показати каталітичну роль ферментів у хімічних перетвореннях. Засвоїти методику визначення активності пептидаз і амілази слини та оцінити їх клініко-діагностичне значення.

Актуальність теми: Знання механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу лежить в основі розуміння метаболічних процесів у клітинах, тканинах та органах організму, що важливо для засвоєння перебігу хімічних перетворень і застосування ферментних препаратів, їх інгібіторів у практичній медицині.

Конкретні завдання:

Ø Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що перебігають у фермент-субстратному комплексі.

Ø Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

Ø Аналізувати механізм дії ферментів на прикладі хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

Теоретичні питання

1. Принципи кількісного визначення активності ферментів:

• за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту;
• за кількістю субстрату, що використовується;
• за зміною кількості коферменту (окисно-відновні перетворення для НАД та ФАД);

2. Одиниці ферментативної активності.

3. Основні положення кінетики ферментативного каталізу:

• залежність швидкості реакції від концентрації субстрату (пояснити і зобразити графічно);
• залежність швидкості реакції від концентрації ферменту (пояснити і зобразити графічно);
• утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату;
• рівняння Міхаеліса-Ментен;
• смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).
• вираз ферментативної реакції в подвійних зворотних величинах; рівняння Лануівера-Берка.

4. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату):

• ефекти зближення та орієнтації;
• ефекти кислотно-основного каталізу;
• ефекти нуклеофільного та електрофільного каталізу.

5. Механізми каталітичної дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

 

Практична робота

 

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 86-137.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 66-107.

3. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.47-62.

5. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – С.11-26.

 

Додаткова:

1. Клінічна біохімія: Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 431 с.

2. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320с.

3. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

4. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

5. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

6. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

Тема № 4. Дослідження регуляції ферментативних процесів та аналіз механізмів виникнення ензимопатій. Медична ензимологія.

Мета заняття: Засвоїти основні принципи регуляції метаболічних шляхів, порушення функціонування ферментів у клітині та використання ферментів у медицині.

Актуальність теми: Ферменти є біокаталізаторами з мінливою активністю, яка змінюється при певних регулюючих впливах. У клінічній практиці ферменти застосовують як фармпрепарати, а визначення їх активності у крові та сечі необхідно для діагностики патологічних станів.

Конкретні завдання:

Ø Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів, як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях;

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів як фармпрепаратів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях;

Ø Пояснювати зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при вроджених (спадкових) та набутих вадах метаболізму – ензимопатіях;

Ø Аналізувати зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патологіях певних органів та тканин.

 

Теоретичні питання

1. Активація та інгібування ферментів. Активатори ферментів (приклади). Інгібування ферментів: зворотне, незворотне, конкурентне, неконкурентне (навести приклади).

2. Регуляція шляхом зміни каталітичної активності ферментів: алостеричні ферменти; ковалентна модифікація ферментів; протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз); дія регуляторних білків; циклічні нуклеотиди в регуляції ферментативних процесів.

3. Регуляція шляхом зміни кількості ферментів (конститутивні та адаптивні ферменти).

4. Ізоферменти (визначення, будова на прикладі лактатдегідрогенази та креатинфосфокінази). Використання ізоферментів для діагностики.

5. Ензимодіагностика (визначення). Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів (інфаркту міокарда, захворювання печінки, підшлункової залози, м’язової тканини).

6. Ензимопатологія (визначення). Вроджені (спадкові) та набуті вади метаболізму, (приклади, їх клініко-лабораторна діагностика).

7. Ензимотерапія (визначення). Використання ферментів, кофакторів та інгібіторів ферментів (ацетилсаліцилова кислота, алопуринол, контрикал, сульфаніламідні пр