Перекисное окисление липидов

Процессы окисления липидов протекают как в живых клетках (in vivo), так и при хранении выделенных липидов (in vitro). Кислород, необходимый для функционирования клеток, является одновременно и токсичным для них веществом. В процессе метаболизма в клетках аэробных организмов постоянно образуются активные формы кислорода, которые при нарушении работы защитных систем организма могут оказывать токсическое действие и приводить к окислительному повреждению тканей и органов. Активными они являются потому, что представляют собой высокореакционные формы, чаще всего свободные радикалы (или их источники), и способны реагировать со многими соединениями клетки или запускать в клетке неконтролируемые свободнорадикальные реакции, которые приводят к повреждению липидов. При окислении жирных кислот образуются перекиси, поэтому такое окисление называют перекисным окислением липидов (ПОЛ). В результате реакций ПОЛ образуется широкий спектр продуктов – промежуточные (алкильные, алкоксильные и гидропероксидные радикалы, гидропероксиды), вторичные (эпоксиды, эндопероксиды, конъюгированные диены и триены, карбонильные соединения) и конечные (продукты рекомбинации радикалов, аддукты альдегидов с биополимерами, спирты, простые эфиры, углеводороды).

Наиболее чувствительны к действию активных форм кислорода полиеновые жирные кислоты, которые в основном локализованы в фосфолипидах биомембран. Свойства мембран изменяются, в них появляются гидрофильные зоны, через которые проникает вода, вызывая набухание клеток и изменение их внутреннего состава. Продукты ПОЛ обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Ионы Са²⁺ и Na⁺ входят в клетки, что приводит к разрушению субклеточных структур. Свободные радикалы проникают в ядро и митохондрии, окисляя ДНК, что ведет к разрыву цепей ДНК и потере митохондриями способности осуществлять синтез АТФ, в результате клетка оказывается в условиях энергетического голода.

Результатом перекисного повреждения мембран клеток является также уменьшение стабильности липидного бислоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом и, как следствие, к разрыву мембраны и полной потере ею своих барьерных функций.

Активные формы кислорода. Прооксиданты. Молекулы кислорода могут принимать по одному электрону из различных реакций и последовательно превращаться в активные формы кислорода (АФК). К ним относятся супероксид-анион-радикал ^•О₂^–, гидроксильный радикал ^•ОН, гидропероксидный радикал ^•ООН, пероксид водорода Н₂О₂:

 

е⁻ е⁻, 2Н⁺ е⁻, Н⁺

^••О₂ → ^•О₂^– → Н₂О₂ → Н₂О + ^•ОН

Супероксид-анион-радикал ^•О₂^– способен непосредственно повреждать большинство биомолекул – липиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, низкомолекулярные метаболиты, практически всегда действует поблизости от места своего образования, не способен проникать через биомембраны.

Гидроксильный радикал ^•OH является одной из наиболее токсичных АФК. Он способен взаимодействовать практически со всеми классами органических соединений.

Пероксид водорода Н₂О₂ практически не может сам по себе индуцировать ПОЛ и окислительное повреждение белков. Токсичность Н₂О₂ для клеток связана с его участием в образовании гидроксильного радикала.

АФК могут образовываться как ферментативным, так и неферментативным путем (табл. 5.2).

Таблица 5.2

Пути образования активных форм кислорода

Ферменты, типы реакций	Механизм	Активные формы кислорода
Ферментативные пути образования АФК
Дыхательная цепь митохондрий	Нарушение переноса электронов в дыхательной цепи приводит к образованию АФК	Главным образом ^•О2^–
Оксидазы	Одним из основных продуктов реакций, катализируемых оксидазами, является Н2О2. При нарушениях функционирования ферментов, а также при катализе реакций с участием некоторых определенных субстратов происходит неполное восстановление кислорода с образованием ^•О2^–	^•О2^–, Н2О2
Липоксигеназа	Катализирует окисление некоторых ненасыщенных жирных кислот (линолевой, линоленовой) с образованием их гидро-перекисей, которые затем неферментативно деградируют с высвобождением свободных радикалов	RO^•
Неферментативные пути образования АФК
Реакция Хабера – Вейсса	^•О2^– + Н2О2 → ^•OH + OH^– + О2 Катализаторами реакции являются металлы переменной валентности	^•OH
Реакция Фентона	Me ^n ^+ + Н2О2 → Me^(n +1)+ + ^•OH + OH^– или Me ^n ^+ + ROOН → Me^(n +1)+ + RO^• + H2O В реакции Фентона участвуют катионы металлов переменной валентности в низшей степени окисления (Fe^2+, Cu^+, Ti^3+, Cr^2+, Co^2+)	^•OH, RO^•

В процессе перекисного окисления липидов окислительной модификации, в первую очередь, подвергаются полиненасыщенные жирные кислоты – олеиновая (С18:1), линолевая (С18:2), линоленовая (С18:3), арахидоновая (С20:4) и их остатки в составе сложных липидов. Растительные масла, содержащие эти жирные кислоты в больших количествах, нестойки при хранении вследствие окисления липидов кислородом воздуха. Начальными продуктами окисления являются разнообразные по строению пероксиды и гидропероксиды, конечными – спирты, альдегиды, кетоны, кислоты и др. Именно эти вещества вызывают появление неприятного запаха и горького вкуса (прогоркание масла). Автокаталитическое (или неферментативное) окисление липидов ускоряется при повышении температуры хранения, а также под действием световой энергии. Ионы металлов переменной валентности (Cu, Fe, Mn, Ni) могут катализировать процесс автоокисления липидов.

Ферментативное окисление липидов протекает при участии ферментов липазы (катализирует гидролиз триацилглицеринов до глицерина и свободных жирных кислот) и липоксигеназы (катализирует окисление ненасыщенных жирных кислот с образованием их гидроперекисей).

Перекисное окисление полиненасыщенных жирных кислот протекает по схеме:

Инициация цепи: LH + ^••O₂ → L^• + HOO^•

где LH – липид, содержащий полиненасыщенные жирные кислоты;

^••O₂ – молекулярный кислород;

L^• – свободный радикал липида;

HOO^• – гидропероксидный радикал.

Развитие цепи: L^• + ^••O₂ → LOO^•

LOO^• + LH → LOOH + L^•

где LOO^• – перекисный радикал липида;

LOOH – гидроперекись липида.

2е⁻, 2Н⁺

Обрыв цепи: LOO^• + L^• → LOOL → 2LOH

L^• + АН → LH + A^•

A^• + A^• → А₂ или A^• + L^• → LА или A^• + LOO^• → LООА

где LOOL – пероксид липидов;

LOH – гидроксид липида;

АН – антиоксидант;

A^• – радикал антиоксиданта;

А₂ – неактивный димер антиоксиданта;

LА – конъюгат липида с антиоксидантом;

LООА – конъюгат перекисного радикала липида с

антиоксидантом.

 

Легче всего свободные радикалы кислорода отрывают электрон от СН₂-групп, находящихся между двумя двойными связями полиненасыщенных жирных кислот. При этом образуется свободный радикал L^• жирной кислоты. Затем в результате развития цепной реакции происходит перемещение двойной связи в сопряженное положение и образуется перекисный радикал липида LOO^•, который реагирует с новой молекулой липида LH с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового свободного радикала липида L^•. Перекисный радикал и гидроперекись липида в отличие от свободного радикала липида представляют собой диеновые конъюгаты, имеющие максимум поглощения в УФ-области спектра. Обрыв цепи происходит при взаимодействии перекисного и свободного радикалов липида с образованием пероксида липидов LOOL и гидроксида липида LOH, а также при взаимодействии свободного радикала липида с антиоксидантом с образованием неокисленного липида и малоактивного радикала антиоксиданта. Последний подвергается димеризации или вступает в реакцию с другими радикалами, образуя неактивные продукты.

Химические соединения и физические факторы, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, принято делить на прооксиданты (ускоряют процессы перекисного окисления липидов) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К прооксидантам относятся высокие концентрации кислорода, ионы Fe²⁺, а также ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.).

Антиоксиданты. Свободнорадикальные процессы в норме происходят в клетке постоянно, но с низкой скоростью, так как клетки имеют различные системы защиты от активных форм кислорода или антиоксидантные системы, которые могут останавливать развитие цепи свободнорадикальных реакций. Их условно делят на неферментные и ферментные.

К неферментным антиоксидантам относятся:

1. Низкомолекулярные антиоксиданты, синтезируемые в организме, – глутатион, мочевая кислота, аминокислоты, содержащие сульфгидрильную SH-группу (цистеин) и др. Особого внимания заслуживают низкомолекулярные белки – металлотионеины, содержащие до 30% цистеина, который в составе этих белков в 770 раз более эффективен в процессе инактивации свободных радикалов, чем цистеин глутатиона.

2. Естественные антиоксиданты, поступающие в организм с пищей, – аскорбиновая кислота (витамин С), a-токоферол (витамин Е), провитамин А, рутин (витамин Р) и другие флавоноиды, b-каротин и другие каротиноиды, меланоидины. Наиболее активен витамин Е: он вследствие своей гидрофобности концентрируется в липидном бислое мембран, где нейтрализует свободные радикалы, связывая их и превращаясь при этом в стабильный (малоактивный) радикал за счет отщепления подвижного атома водорода ОН-группы. Кроме витаминов и их предшественников, к этой же группе веществ могут быть отнесены химические элементы, входящие в состав активных центров антиоксидантных ферментов, – селен, четыре атома которого входят в состав глутатионпероксидазы; цинк, медь, входящие в состав супероксиддисмутазы, и др.

3. Специфические белки и пептиды, связывающие ионы металлов переходной валентности, которые являются катализаторами реакций свободнорадикального окисления липидов, – ферритин, трансферин и церулоплазмин (в плазме крови), карнозин (в мышцах) и др.

Антиоксидантами могут выступать и искусственно синтезированные соединения – ионол (2,6-ди- трет -бутил- п -крезол), бутилокситолуол, додецилгаллат и др.

К ферментным антиоксидантам относится ряд гемсодержащих ферментов, инактивирующих активные формы кислорода:

· супероксиддисмутаза, катализирующая реакцию

2^•О₂^– + 2 Н⁺ → Н₂О₂ + О₂

· каталаза, катализирующая реакцию

2Н₂О₂ → О₂ + 2Н₂О

· глутатионпероксидаза, катализирующая реакцию

Н₂О₂ + 2GSH → 2Н₂О + GSSG (GSH – глутатион).

Исследование влияния антиоксидантов на процесс перекисного окисления липидов. Одним из конечных продуктов деградацииполиненасыщенных жирных кислот при перекисном окислении липидов является малоновый диальдегид ОНС−СН₂−СНО. Это химически очень активное вещество, которое своими альдегидными группами взаимодействует с NH₂-группами белков, вызывая их необратимую денатурацию. О протекании реакции перекисного окисления липидов судят по образованию в результате взаимодействия при высокой температуре в кислой среде малонового диальдегида с 2-тиобарбитуровой кислотой окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм. Интенсивность красного окрашивания пропорциональна интенсивности процесса перекисного окисления липидов, т. е. чем интенсивнее окрашен раствор, тем больше количество образовавшихся продуктов перекисного окисления липидов. Сравнивая между собой интенсивности окрашивания растворов, содержащих разные антиоксиданты и без них, делают вывод о степени окисляемости липидов и влиянии антиоксидантов на интенсивность перекисного окисления липидов.