Исследование процесса перекисного окисления липидов

0,2 мл полученного липидного экстракта помещают в пробирку и выпаривают растворитель при комнатной температуре. Затем к экстракту добавляют 1,1 мл 96%-ного этилового спирта и 0,3 мл дистиллированной воды. Пробирку интенсивно встряхивают для максимальной дезинтеграции и полного эмульгирования капель липидов.

К липидной эмульсии добавляют 0,2 мл 1 · 10⁻² М раствора исследуемого антиоксиданта (маннит, глутатион, a-токоферол (см. примечание) или ионол). Реакцию перекисного окисления липидов запускают добавлением 0,2 мл 2 · 10⁻² М раствора FeSO₄ и 0,2 мл 0,2 М раствора Н₂О₂ (реакция Фентона).

Параллельно готовят две контрольных пробирки для проверки:

· перекисного окисления липидов в отсутствие антиоксиданта (к липидной эмульсии добавляют растворы FeSO₄ и Н₂О₂, а вместо раствора антиоксиданта - дистиллированную воду);

· самопроизвольного или автоокисления липидов (к липидной эмульсии вместо растворов антиоксиданта, FeSO₄ и Н₂О₂ добавляют дистиллированную воду).

Пробирки помещают в термостат и выдерживают при температуре 37°С в течение 24 ч.

Затем к 0,5 мл содержимого каждой пробирки последовательно вносят:

· 0,5 мл 1%-ного раствора тритона Х-100;

· 0,2 мл 0,6 М раствора НСl;

· 0,8 мл 0,06 М раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК) в 50%-ном этаноле с 1% тритона Х-100.

Пробирки нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Затем их охлаждают при температуре 15°С на протяжении 30 мин. Для стабилизации окраски после охлаждения пробирок к смеси добавляют 0,2 мл 5 мМ раствора трилона Б и 5 мл 96%-ного этанола.

Измеряют экстинкцию растворов при 532 нм в кюветах (l = 0,5 см) на фотоэлектроколориметре против контрольной пробы, содержащей растворы тритона Х-100, НСl и 1%-ный раствор тритона Х-100 в 50%-ном этаноле вместо раствора ТБК.

Каждое определение проводят 3 раза и за результат измерения принимают среднее арифметическое значение экстинкции.

Сравнивают между собой интенсивности окрашивания растворов, содержащих разные антиоксиданты и без них и рассчитывают количество малонового диальдегида в каждой пробе, используя коэффициент молярной экстинкции окрашенного триметинового комплекса:

(5.2)

где С _МА – молярная концентрация малонового диальдегида, М; Е ₅₃₂ – поглощение или экстинкция раствора при 532 нм; e - коэффициент молярной экстинкции триметинового комплекса, равный 1,56 · 10⁵ М^-1·см^-1; l – толщина кюветы, см.

Делают вывод о степени окисленности липидов и влиянии антиоксидантов на интенсивность перекисного окисления.

Примечание. При использовании в качестве антиоксиданта a-токоферола последний получают путем гидролиза фармакопейного a-токоферола ацетата непосредственно перед использованием.

 

a-токоферола ацетат a-токоферол

 

Для этого 21,5 мг a-токоферола ацетата смешивают с 25 мл этанола (96 об.%). К 8 мл этой смеси добавляют 2 мл дистиллированной воды и 1−2 капли 1 н раствора NaOH. Содержимое перемешивают на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение часа. Концентрация a-токоферола в растворе составляет 1,6 · 10⁻³ М.

Вопросы для самоконтроля

 

1. Что собой представляют липиды и какими свойствами они обладают? Каковы биологические функции липидов?

2. Приведите классификации липидов.

3. Из каких органических соединений построены триацилглицерины? Дайте им характеристику.

4. В чем проявляется нестабильность цис -изомеров ненасыщенных жирных кислот?

5. Напишите структурную формулу холестерина. Укажите его биологические функции.

6. Какие классы липидов относятся к полярным липидам? Как структура полярных липидов связана с их функциями?

7. Что общего в структуре каждого из классов полярных липидов? Покажите на конкретных примерах.

8. Каким образом и при каких условиях формируются разные типы липидных агрегатов? Какими свойствами они обладают?

9. Перечислите функции биомембран в клетке.

10. В чем состоит суть жидкостно-мозаичной модели строения цитоплазматической мембраны?

11. По какому принципу мембранные белки делят на периферические и интегральные? Свяжите это с особенностями выделения этих белков из мембраны.

12. В чем состоят принципиальные отличия между известными типами транспортных белков?

13. Какие ферменты функционируют в клеточных мембранах?

14. Охарактеризуйте такие свойства биомембран, как текучесть и асимметрия.

15. Дайте определение понятия «перекисное окисление липидов». Каковы последствия этого процесса для клеток?

16. Что относится к активным формам кислорода? В чем проявляется их токсичность для клеток?

17. Перечислите пути образования активных форм кислорода. Какие жирные кислоты в наибольшей степени подвержены перекисному окислению?

18. Приведите схему перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот.

19. Какое влияние оказывают на процессы перекисного окисления липидов прооксиданты и антиоксиданты? Приведите примеры.

20. Назовите стадии выделения липидов из биологического материала? В чем состоят их особенности?

21. Какие хроматографические методы применяются для качественного и количественного анализа липидов?

22. Объясните принцип метода газо-жидкостной хроматографии. Каким образом с помощью этого метода проводят качественный и количественный анализ липидов?

23. В чем состоят особенности ГЖХ-анализа триацилглицеринов?

24. Объясните принцип метода тонкослойной хроматографии. Каким образом с помощью этого метода проводят качественный анализ липидов?

25. По какому признаку судят о протекании реакции перекисного окисления липидов? Как оценивают влияние антиоксидантов на интенсивность перекисного окисления липидов?