Иммунологические реакции третьего поколения

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции (метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

• Прямой метод РИФ (рис. 2 27) основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами (например, флюоресцеинизотиоцианатом), способны светиться в УФ- и синих лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой и отмытые буфером, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

• Непрямой метод РИФ (рис. 2.28) заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой сыворотки (против первичных антител), меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают первичными антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. Непрямая РИФ улучшает выявление слабо выраженных антигенов благодаря тому, что к первичному антителу может присоединяться несколько молекул меченого антитела.

Непрямой метод также применяют для выявления антител в сыворотке больного. Для этого на готовый тест-мазок из микробов наносят сыворотку крови больного и после отмывки от непрореагировавшей сыворотки мазок окрашивают антиглобулиновой (против иммуноглобулинов человека) сывороткой меченой флюоресцеин изотиоцианатом. После отмывки мазок микроскопируют в люминесцентном микроскопе.

 

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ - выявление антигенов или антител с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой
(пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген (субарат для пероксидазы - перекись водорода, а хромоген - тетраметилбензидин, 5-аминосалициловая кислота, ортофенилендиамин и др.). Субстрат расщепляется ферментом, что в конечном итоге приводит к изменению цвета продукта реакции: интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (рис. 2 31-2.33). Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты.

ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатита В и др., а также для определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в малых концентрациях (10¹⁰-10¹² г/л).

• Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания.

1. При определении антител (рис. 2.31) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

2. При определении антигена (рис. 2.32) в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (например, сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку пр01ив нею и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

• Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомые антигены и меченые ферментом антигены конкурируют друг с другом за антитела, сорбированные на твердой фазе (рис. 2 34).

• Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

 

Радиоиммунный анализ

 

Радиоиммунный анализ - высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радионукпидом (¹²⁵J, ¹⁴С, ³Н, ⁵¹Сг и др.).
После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (или вестернблоттинг) -высокочувавительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА (рис. 2.37). ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Метод переноса пятен ДНК первоначально разработал в 1975 г. Саузерн (фамилия Southern в переводе означает
«южный»), метод получил название саузернблоттинг (южный перенос) Метод переноса фрагментов РНК назвали нозернблоттинг (северный перенос), а метод переноса фрагментов белка - вестернблоттинг (западный перенос)

 

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ. blоt - пятно) из геля на активированную бумагу (1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного (2). Затем, после инкубации, отмывают от не связавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом (3). Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата (4), изменяющего окраску под действием фермента.