Глава 26. Регуляция клеточного цикла

Клеточный цикл представляет собой однонаправленный процесс, где клетка последовательно проходит разные его периоды, без их пропуска или возврата к предыдущим стадиям. Вступив в клеточный цикл, клетка его заканчивает синтезом ДНК и делением клетки (рис. 345).

Однако, как уже говорилось, клетки могут выходить из цикла, переходить в стадию покоя, или в G₀-стадию. В многоклеточных организмах многие клетки теряют способность к пролиферации, к размножению, теряют способность переходить из стадии покоя в первую стадию пролиферации, в G₁-стадию, которая начинает путь клетки к ее делению. К таким клеткам относятся нейроны, кардиомиоциты, клетки хрусталика и многие другие. Существуют также органы с редко делящимися клетками; так, например, клетки печени могут входить в клеточный цикл через несколько месяцев покоя. Быстро размножающиеся клетки взрослых организмов, такие как кроветворные, или базальные клетки эпидермиса и тонкой кишки могут входить в клеточный цикл каждые 12-36 часов. Самые короткие клеточные циклы, около 30 мин, наблюдаются при быстром дроблении яиц низших организмов (иглокожие, земноводные). В экспериментальных условиях короткий (20 час) клеточный цикл имеют многие линии клеточных культур.

Что определяет вступление клеток в пролиферацию и что определяет закономерную последовательность смены периодов клеточного цикла – эти вопросы долгое время оставались без ответа.

Считалось, что для начала вступления в клеточный цикл необходим рост живой массы клетки, образование веществ для деления, в частности ДНК и белка, создания определенного уровня энергетических запасов и т.д.

Фактор стимуляции митоза

Расшифровка регуляции процессов клеточного деления началась в 70е годы прошлого века, когда были найдены методы слияния разных клеток, методы получения гетерокарионов (о них см. главу 2). Оказалось, что можно получить слияние не только интерфазных клеток с интерфазными, но и интерфазных с митотическими клетками (рис. 114). При этом обнаружилось удивительное удивительное явление: в такой гибридной клетке, где были митотические хромосомы одной из исходных клеток, в ядрах от интерфазных клеток начиналась конденсация хромосом, разрушалась ядерная оболочка и образовывались т.н. преждевременно конденсированные хромосомы (ПКХ или РСС – preliminary condenced chromosomes). Причем структура ПКХ зависела от стадии интерфазного ядра: в ядре от G₁ клетки появлялись однонитчатые длинные ПКХ, в ядре от G₂ клетки ПКХ были двойными (т.к. после S-периода хромосомы удвоились). Эти наблюдения наводили на мысль, что при слиянии таких клеток на интерфазные ядра действуют какие-то факторы, содержащиеся в митотических клетках.

Для проверки этого предположения были поставлены опыты со слиянием клеток на разных стадиях клеточного цикла (см.табл.)

Таблица. Результаты слияния клеток на разных стадиях (G_1, S, G_2,M) клеточного цикла

Исходные клетки	гетерокарион
G2® G1	Нет влияния
S ® G1	Синтез ДНК
S ® G2	Нет влияния
M ® G1	М (ПКХ)
M ® S	М (ПКХ)
M ® G2	М (ПКХ)

 

Эти эксперименты были дополнены тем, что часть цитоплазмы митозной клетки инъецировали в цитоплазму G₁-интерфазной клетки. Это приводило к появлению в ядре интерфазной клетки ПКХ. Из этих наблюдений был сделан ввод о том, что в цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы), стимулирующие митоз (ФСМ или MPF – mitosis promoting factor). Этот фактор вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной оболочки, т.е. переводит интерфазную клетку, даже без синтеза ДНК, в митотическое состояние (конечно, дальше появления конденсированных хромосом развитие митоза не идет).

Параллельно с этими наблюдениями были проведены эксперименты на созревающих и дробящихся яйцеклетках лягушек X.laevis (рис. 346).

Ооцит X.laevis после репликации ДНК и короткой G₂–стадии переходит в мейотическую профазу I, во время которой в течение 8 месяцев происходит рост и созревание ооцита, он дорастает до размера зрелой икринки. При спаривании овариальные клетки самки выделяют гомон прогестерон, который стимулирует переход из профазы в I мейотическое деление (митоз I), затем после короткой интерфазы наступает II мейотическое деление, которое на некоторое время останавливается на стадии метафазы (стадия яйца). При оплодотворении спермием метафаза завершается, происходит второе деление меойза, после чего гаплоидное ядро яйцеклетки сливается с ядром спермия, и образуется диплоидная зигота. После этих событий следуют через каждые 30 мин многочисленные деления клеток развивающейся бластулы (рис. 346а).

Если взять с помощью микроманипулятора небольшую часть цитоплазмы из ооцита на стадии метафазы II мейотического деления и инъецировать ее в цитоплазму не стимулированного прогестероном ооцита, то произойдет повторение описанного выше процесса: ооцит вступит в I деление мейоза, а затем и во II деление, т.е. произойдет его созревание (рис. 346в). Таким образом было найдено, что в ооците на стадии метафазы II деления в цитоплазме существует фактор (или факторы), стимулирующие созревание яйцеклетки (ФСС или MPF – maturation promoting factor).

Оказалось, что этот фактор (будем называть его MPF) присутствует в клетках только во время митотического состояния. Он обнаруживается также и во время дробления яйцеклетки (рис. 347). Таким образом, уровень MPF в интерфазных клетках низкий, а в митотических высокий.

Далее было найдено, что при инъекции цитоплазмы из митотических клеток культуры ткани в нестимулированный ооцит X. laevis, происходит созревание ооцита. Следовательно, фактор, стимулирующий митоз и фактор, стимулирующий созревание ооцитов – одно и тоже.

Этот фактор, MPF, был выделен и охарактеризован. Это гетеродимерный комплекс, состоящий из белка циклина (см. ниже) и зависимой от циклина протеинкиназы (Cyclin dependent kinase – Сdk), фермента, относящегося к фосфорилазам, который модифицирует белки, перенося фосфатную группу от АТФ на аминокислоты серин и треонин. Следовательно, MPF состоит из двух субъединиц: каталитической (Сdk) и регуляторной (циклин) (рис. 348).

Циклины

Циклин был обнаружен при изучении включения меченых аминокислот в синхронно дробящиеся яйца морского ежа. Было обнаружено, что в одном из белковых пиков на электрофореграммах метка периодически то появляется, то исчезает: она появлялась после клеточного деления, постепенно возрастала к митозу, а затем ее уровень падал после анафазы, и потом снова начинал возрастать в следующей интерфазе. Этот белок был назван циклином. Он постоянно синтезируется в течение эмбрионального клеточного цикла и резко разрушается при вступлении в анафазу. Подобный митотический циклин В был обнаружен у всех эукариот, в том числе и у X. laevis.

В раннем эмбриогенезе, т.е. при дроблении яиц X. laevis, первые 12 делений идут друг за другом при минимальной величине G₁ и G₂ периодов, и возрастание уровня MPF происходит во время каждого деления. Интересно, что дробление яиц и циклические изменения активности MPF происходят также без участия ядер. Это значит, что для появления активности MPF не нужна транскрипция информационных РНК. В этот период все клеточные белковые синтезы идут на долгоживущих матричных РНК, синтезированных еще во время роста ооцитов в мейотической профазе.

Расшифровка природы активности MPF была получена на модельных экспериментах с использованием цитоплазматических экстрактов активированных яиц X. laevis. В этих экстрактах были все компоненты для поддержания клеточного цикла: ферменты и предшественники для синтеза ДНК, гистоны и другие белки и липиды для образования ядерной оболочки, так же как и мРНК, необходимая для синтеза белков, и в том числе циклина В.

Если к такому экстракту добавить хроматин из спермиев X. laevis, то вокруг хроматина образуется ядерная оболочка, затем происходит синтез ДНК, следует конденсация хромосом, разрушается ядерная оболочка, образуется митотическая фигура, и потом наступает интерфаза, и цикл повторяется через каждые 20 мин снова и снова. По мере прохождения каждого цикла происходило сначала нарастание циклина В в интерфазе параллельно возрастанию активности MPF. В митозе после анафазы количество циклина В и активность MPF падали, т.е. происходило циклическое изменение двух параметров (рис. 349). По мере возрастания уровня MPF при повышении активности Сdk происходила конденсация хромосом за счет фосфорилирования конденсинов и гистона Н1, распад ядерной оболочки при фосфорилировании ламинов, образование веретена деления, т.е. все атрибуты митотического аппарата.

Подавление синтеза белка циклогексимидом или разрушение всей mРНК с помощью РНК-азы полностью снимало циклику MPF и циклина В. Если после действия РНК-азы и при последующем ее удалении ввести в экстракты mРНК только для циклина В, то периодические изменения уровней MPF и циклина В восстанавливаются (рис. 349в). Эти данные говорят о том, что в системе MPF только циклин В синтезируется в интерфазе и деградирует в анафазе. В то время как второй компонент, а именно протеинкиназа Сdk существует долгое время и активируется при появлении циклина В.

Деградация циклина В в анафазе вызывается сложной цепочкой белковых взаимодействий, которая приводит к его расщеплению с помощью сложных белковых протеолитических комплексов – протеосом. Кроме того, в начальных этапах деградации циклина участвует сложный белковый комплекс АРС (комплекс стимулирующий анафазу), который не только подготавливает циклин к деградации, но одновременно приводит к деградации когезинов, удерживающих хроматиды друг с другом вплоть до анафазы.

Общая схема регуляции митотического циклина В и MPF в циклирующих клетках может быть представлена на рис 350.