Контрастирование корпускулярных объектов

Корпускулярными объектами можно назвать частички вирусов, фагов, выделенные клеточные компоненты (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.), макромолекулы.

Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металлами. В этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом, напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден. Этот метод широко применяется не только для контрастирования вирусов, рибосом, но и для достаточно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого метода в том, что он приводит к увеличению размеров объекта на толщину напыленного слоя, который в лучшем случае достигает 10-15 А. Другой недостаток его в том, что он дает информацию только о внешнем виде и объеме частиц. Для контрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, уран.

При негативном контрастировании объектов растворами солей тяжелых металлов применяют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту (ФВК) (рис. 10). Если водные растворы таких веществ смешать с биологическими объектами, а затем их нанести на пленки-подложки и высушить, то объекты (например, вирусы или белковые комплексы) окажутся как бы погруженными в тонкий слой аморфного вещества высокой плотности. В электронном микроскопе они выглядят как светлые объекты на темном фоне (как фотонегатив). Преимущества метода в том, что растворенные соли могут проникать в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное контрастирование широко применяется при изучении вирусов, ферментных комплексов мембран. Нитчатые молекулы нуклеиновых кислот этим методом выявляются плохо из-за их малой толщины.

Соли тяжелых металлов можно использовать при так называемом позитивном контрастировании. В этом случае контрастирующее вещество связывается со структурой, повышает ее электронную плотность. Часто для позитивного контрастирования нуклеиновых кислот используют растворы уранилацетата в спирте или в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, хорошо прокрашивает центральные полости сферических вирусов, значительно повышает контраст рибосом и позволяет видеть тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот.

Ультрамикротомия

При изучении объектов в электронном микроскопе возникает еще одно осложнение – это их толщина. Дело в том, что при прохождении пучка электронов через объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. Поэтому необходимо иметь тонкие объекты (не выше 0,1 мкм). Другое ограничение заключается в том, что даже если мы будем рассматривать неизменяющиеся объекты большой толщины (около 0,5-1 мкм), что в принципе возможно (например, в мегавольтном электронном микроскопе, см. ниже), то на конечном изображении будут наслаиваться проекции структур, располагающихся на разных уровнях по толщине объекта. Тем самым изучать в трансмиссионных микроскопах внутреннее строение целых клеток плохо и неудобно. Выход из этого положения аналогичен тому, что было найдено для световой микроскопии, - делать срезы очень малой толщины, ультратонкие срезы (0,05-0,10 мкм).

Процедура их изготовления в принципе сходна стой, что используется в световой микроскопии. Клетки и ткани для этого сначала фиксируют. В качестве фиксаторов используются буферные растворы глутарового альдегида или четырехокиси осмия. Наиболее часто применяется двойная фиксация: сначала глутаровый альдегид, а затем осмий, который как тяжелый металл контрастирует клеточные структуры. Затем, после обезвоживания, ткани пропитываются эпоксидными смолами или другими пластиками в жидкой, мономерной форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резать на тонкие срезы. Здесь возникают две проблемы: где взять идеальные ножи, изъяны которых не сказывались бы при изучении клеток на почти молекулярных уровнях, и как изготовить срезы толщиной в сотые доли микрона. Первая задача была решена таким образом: оказалось, что идеально острой и без зазубрин режущей поверхностью обладают сколы стекла (рис. 11). Но стеклянные ножи очень недолговечны, их используют только один раз. Применяют алмазные ножи: это специальным образом заточенные мелкие алмазы, они служат в течение нескольких лет.

Проблема изготовления сверхтонкого среза была решена тоже, казалось бы, просто – это термическая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассу объектом крепится на металлическом стержне, который нагревается и тем самым продвигает объект вперед на определенную величину за известное время. И если эту термическую подачу согласовать с ритмическими циклами резания, то можно получить серии срезов заданной толщины. Это достигается при использовании специальных приборов – ультрамикротомов. Существуют конструкции ультрамикротомов, где подача объекта осуществляется механически.

Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм²), поэтому все операции при ультрамикротомировании идут под микроскопическим контролем. Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, необходимо дополнительно контрастировать – «окрашивать» с помощью солей тяжелых металлов. В этом случае используют также соли свинца и урана, которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно их контрастируют.

Техника изготовления ультратонких срезов открыла огромные возможности для применения электронной микроскопии буквально во всех областях биологии и медицины

Этот метод позволяет применять цитохимические приемы на уровне электронной микроскопии: в данном случае необходимо, чтобы продукты реакции были электронноплотными, отклоняли бы электроны. Кроме того, реакции не должны приводить к появлению артефактных картин уже на ультраструктурном уровне. Число цитохимических методов в электронной микроскопии пока не велико, но это направление интенсивно разрабатывается.

В электронно-микроскопических исследованиях оказалось возможным применить методы радиоавтографии. В этом случае используются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм). Недостатком этого метода является очень большое время экспозиции, в некоторых случаях достигающие нескольких месяцев.

Все большее применение получают методы приготовления ультратонких срезов без фиксации и заливки клеток в твердые пластмассы. Это методы криоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (-196^оС). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую, ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют для выявления в них активности ферментов, для проведения на них иммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.

Для проведения иммунохимических исследований используют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализация которого на препаратах и указывает на места расположения искомого антигена.

Изучение срезов, полученных на криоультратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонентов в данном случае мало отличаются от того, что видно при использовании химической фиксации и обычных приемов получения ультратонких срезов. Следовательно, те структуры, которые имеют одинаковую композицию при разных методах обработки материала, по-видимому, близки к своему прижизненному строению, не являются артефактными.

В пользу этого говорят данные по исследованию клеток с помощью иных приемов электронной микроскопии.

Для изучения структуры различных мембранных компонентов клетки используется метод замораживания–скалывания. Он заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом с замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику с его скола (рис. 12). Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронном микроскопе. Этот метод имеет два преимущества: изучают реплики со сколов нативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, что недостижимо другими методами. Оказалось, что и в этом случае общая организация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим при химической фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что как на поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулы интегральных белков, что мембраны не однородны по своей структуре.

Метод получения реплик с микрорельефа образца широко применяется при изучении фибриллярных компонентов клетки. Так при изучении цитоскелета клеток культуры ткани или форменных элементов крови клетки обрабатывают детергентами для того, чтобы растворить все мембраны. Это приводит к тому, что из клетки вымываются все компоненты, кроме фибриллярных белковых компонентов цитоскелета и материалы ядра. Такие препараты затем фиксируются, обезвоживаются и специальным образом сушатся. Вслед за этим сухие препараты напыляются углеродом и контрастируются распылением тяжелых металлов, после чего такая реплика снимается со стекла, на котором росли клетки, и просматривается в трансмиссионном электронном микроскопе.