Ядерные транскрипты и их транспорт

Одна из важнейших функций клеточного ядра является реализация генетической информации в виде синтеза целого ряда РНК или служащих матрицами для синтеза белка, или образующих аппарат белкового синтеза. Синтез разного типа РНК на матрицах ДНК хроматина, транскрипция, включает в себя образование нескольких типов РНК, синтезируемых с помощью различных РНК-полимераз, ферментов синтезирующих РНК по одной из цепей матричной ДНК. Всего в эукариотических клетках встречается 5 типов РНК (см. табл. 8).

Таблица 8. Типы РНК, их количество, стабильность и ферменты, участвующие в их синтезе.

№№ пп	Тип РНК	Количество в %	% синтезированных молекул за ед времени	Фермент
	иРНК рРНК тРНК мяРНК митРНК	50-70		РНК-полимераза II РНК-полимераза I РНК-полимераза II РНК-полимераза II

 

Информационные РНК, самые разнообразные по величине и по строению нуклеотидных последовательностей являются самыми нестабильными по времени их жизни: они синтезируются в большом количестве и быстро деградируют, что обеспечивает смену функциональных активностей клетки. В связи с их быстрой заменой общее число их относительно невелико, 10% от массы всех РНК в клетке. Эти иРНК синтезируются при участии фермента РНК-полимеразы II, которая может образовывать первичную копию РНК с любого гена, кодирующего структуру белка. Дальнейшее созревание этих первичных транскриптов, их значительное укорочение и перестройка (сплайсинг – см. ниже) происходит с помощью особых рибонуклеопротеидных частиц, содержащих малые ядерные РНК (мяРНК). Эти мяРНК сннтезируются также с помощью этого фермента, их количество в клетке невелико (5%), но они более стабильны и долгоживущие. К мяРНК относится целая гетерогенная группа РНК, входящая в состав малых РНП-частиц, таких как SRP, теломераза, сплайсосомы и др. (см. ниже). Все остальные клеточные РНК необходимы для создания аппарата белкового синтеза. Рибосомные РНК синтезируются с помощью РНК-полимеразы I, они представляют основную массу клеточных РНК и относительно стабильны. Одна из рибосомных РНК, 5S РНК, а также 20 трансферных РНК, тоже стабильных, синтезируются с помощью РНК-полимеразы III. Митохондриальные РНК синтезируются в самих митохондриях независимо от синтеза РНК в ядре.

Реализация генетической информации, выражающаяся в синтезе разнообразных молекул РНК должна быть связана с изменением морфологии ядерных компонентов. На светооптическом уровне активация ядерной транскрипции всегда связана с деконденсацией хроматина, с увеличением объема ядрышек, с повышением их базофилии, т.е. с увеличением в них количества РНК. Эти общие признаки увеличения ядерной активности мало что дают для понимания хода молекулярных процессов на уровне реальных ядерных компонентов. Что происходит с участками хроматина, заключающими индивидуальный ген, кодирующий определенный белок, изучать очень трудно, т.к. эти гены в подавляющем большинстве случаев существуют в единичных копиях и проследить в гигантском клубке деконденсированных интерфазных хромосом за работой индивидуального гена чрезвычайно трудно (хотя и возможно).

Относительно более просто эту же задачу можно решить на генах многократно повторенных в геноме, таких как гены рибосомных РНК, входящих в состав интерфазных ядрышек, основной функцией которых является образование рибосом. Изучая ультраструктуру ядрышек и особенности морфологии синтеза рибосомных РНК впервые удалось с помощью электронного микроскопа визуализировать работающий ген.

 

Глава 8. Ядрышко – источник рибосом

Внутри интерфазных ядер как при витальных наблюдениях, так и на фиксированных и окрашенных препаратах видны мелкие, обычно шаровидные тельца – ядрышки. Впервые ядрышки были описаны Фонтана в 1774 г. В живых клетках они выделяются на фоне диффузной организации хроматина из-за своей светопреломляемости. Последнее свойство связано с тем, что ядрышки являются наиболее плотными структурами в клетке. Ядрышки обнаруживаются практически во всех ядрах эукариотических клеток за редким исключением. Это говорит об обязательном присутствии этого компонента в клеточном ядре.

В клеточном цикле ядрышко присутствует в течение всей интерфазы: в профазе по мере компактизации хромосом во время митоза оно постепенно исчезает, и отсутствует в мета- и анафазе, и вновь появляется в середине телофазы, чтобы сохраняться вплоть до следующего митоза, или до гибели клетки.

Долгое время функциональное значение ядрышка было непонятно. Вплоть до 50- годов исследователи считали, что вещество ядрышка представляет собой своего рода запас, который используется и исчезает в момент деления ядра.

Однако еще в 30-х годах рядом исследователей (МакКлинток, Хейтц, Навашин) было показано, что возникновение ядрышек связано топографически с определенными зонами на особых, ядрышкообразующих хромосомах. Эти зоны были названы ядрышковыми организаторами, а сами ядрышки представлялись как структурное выражение хромосомной активности. Позднее в 40-х годах, когда было найдено, что ядрышки содержат РНК, стала понятна их «базофилия», сродство к основным (щелочным) красителям, из-за кислой природы РНК. По данным цитохимических и биохимических исследований основным компонентом ядрышка является белок: на его долю приходится до 70-80% от сухого веса. Такое большое содержание белка и определяет высокую плотность ядрышек. Кроме белка в составе ядрышка обнаружены были нуклеиновые кислоты: РНК (5-14%) и ДНК (2-12%).

Уже в 50-х годах при изучении ультраструктуры ядрышек в их составе были обнаружены гранулы, сходные по своим свойствам с цитоплазматическими гранулами рибонуклеопротеидной природы, с рибосомами. Следующим этапом в изучении ядрышка было открытие принципиального факта – «ядрышковый организатор» является вместилищем генов рибосомных РНК.

Строение рибосом

Рибосома представляет собой элементарную клеточную машину синтеза любых белков клетки. Все они построены в клетке одинаково, имеют одинаковую молекулярную композицию, выполняют одинаковую функцию – синтез белка – поэтому их можно так же считать клеточными органоидами. В отличие от других органоидов цитоплазмы (пластид, митохондрий, клеточного центра, мембранной вакуолярной системы и др.) они представлены в клетке огромным числом: за клеточный цикл их образуется 1 х 10⁷ штук. Поэтому основная масса клеточной РНК представляет собой именно рибосомную РНК. РНК рибосом относительно стабильна, рибосомы могут существовать в клетках культуры ткани в течение нескольких клеточных циклов. В печеночных клетках время полужизни рибосом составляет 50-120 часов.

Рибосомы – это сложные рибонуклеопротеидные частицы, в состав которых входит множество молекул индивидуальных (неповторенных) белков и несколько молекул РНК, Рибосомы прокариот и эукариот по своим размерам и молекулярным характеристикам отличаются, хотя и обладают общими принципами организации и функционирования. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа высокого разрешения полностью расшифрована структура рибосом.

Полная, работающая рибосома, состоит из двух неравных субъединиц, которые легко обратимо диссоциируют на большую субъединицу и малую. Размер полной прокариотической рибосомы составляет 20 х 17 х 17 нм, эукариотической – 25 х 20 х 20. Полная прокариотическая рибосома имеет коэффициент седиментации 70S и диссоциирует на две субъединицы: 50S и 30S. Полная эукариотическая рибосома, 80S рибосома, диссоциирует на 60S и 40S субъединицы. Форма и детальные очертания рибосом из разнообразных организмов и клеток, включая как прокариотические, так и эукариотические, поразительно похожи, хотя и отличаются рядом деталей. Малая рибосомная субъединица имеет палочковидную форму с несколькими небольшими выступами (см. рис. 81), ее длина составляет около 23 нм, а ширина – 12 нм. Большая субъединица похожа на полусферу с тремя торчащими выступами. При ассоциации в полную 70S рибосому малая субчастица ложится одним концом на один из выступов 50S частицы, а другим в ее желобок. В состав малых субъединиц входит по одной молекуле РНК, а в состав большой – несколько: у прокариот – две, а у эукариот – 3 молекулы. Характеристики молекулярной композиции рибосом даны в таблице 9.

Таблица 9. Молекулярная характеристика рибосом

Объект	Коэффициент седиментации полной рибосомы и ее субъединиц	Кол-во молекул РНК на субъеди-ницу	Молеку-лярный вес РНК	Коэффи-циент седиментации РНК	Кол-во белковых молекул на субъединицу
30S 1 0,56 х 10^6 16S 21 Рибосомы 70S Прокариот 50S 2 1,2 х 10^6 23S 34 4,0 х 10^4 5S   40S 1 0,6 х 10^6 18S Рибосомы 80S Эукариот 60S 3 1,6 х 10^6 28S Всего 4,0 х 10^4 5S около 4,5 х 10^4 5,8S 80

 

Таким образом в состав эукариотической рибосомы входят четыре молекулы РНК разной длины: 28S РНК содержит 5000 нуклеотидов, 18SРНК – 2000, 5,8S РНК – 160, 5SРНК – 120.Рибосомные РНК обладают сложной вторичной и третичной структурой, образуя сложные петли и шпильки на комплементарных участках, что приводит к самоупаковке, самоорганизации этих молекул в сложное по форме тело. Так, например, сама по себе молекула 18S РНК в физиологических ионных условиях образует палочковидную частицу, определяющую форму малой субъединицы рибосом.

Под действием низких ионных сил, особенно при удалении ионов магния, плотные рибосомные субъединицы могут разворачиваться в рыхлые рибонуклеопротеидные тяжи, где можно наблюдать кластеры отдельных белков, но правильных структур, типа нуклеосом, нет, т.к. нет групп из сходных белков: в рибосоме все 80 белков разные.

Для того, чтобы образовались рибосомы необходимо наличие четырех типов рибосомных РНК в эквимолярных отношениях и наличие всех рибосомных белков. Сборка рибосом может происходить спонтанно in vitro, если последовательно добавлять к РНК белки в определенной последовательности.

Следовательно для биосинтеза рибосом необходим синтез множества специальных рибосомных белков и 4-х типов рибосомной РНК. Где эта РНК синтезируется, на каком количестве генов, где эти гены локализованы, как они организованы в составе ДНК хромосом – все эти вопросы в последние десятилетия были успешно разрешены при изучении строения и функции ядрышек.