Витальное (прижизненное) изучение клеток

Световой микроскоп позволяет видеть живые клетки. Для кратковременного наблюдения клетки помещают просто в жидкую среду на предметное стекло; если нужно длительное наблюдение за клетками, то используются специальные камеры. Это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же разборные плоские камеры. В качестве объектов можно использовать свободноживущие клетки простейших и других одноклеточных организмов, клетки крови или же разобщенные тканевые клетки многоклеточных организмов как животного, так и растительного происхождения. В любом из этих случаев клетки изучают в специально подобранных средах. Свободноживущие одноклеточные организмы рассматривают и изучают в тех же средах, в которых они живут в естественных условиях или культивируются в лаборатории. Так, для некоторых простейших созданы искусственные среды, на которых они растут и размножаются. Обычно это сбалансированные солевые растворы с добавками микроорганизмов или других простейших, служащих пищей для данного вида организма.

Клетки крови или другие свободные клетки многоклеточных могут изучаться в капле плазмы или в специальных синтетических средах.

Для изучения клеток органов и тканей животных используют метод клеточных культур. Более простой вариант этого метода заключается в том, что в камеру, наполненную питательной средой (смесь плазмы крови с эмбриональным экстрактом или смесь синтетической среды с добавлением плазмы крови), помещают небольшой кусочек живой ткани. Через некоторое время на периферии такого кусочка начинается деление и рост клеток. В другом случае вырезанный кусочек ткани слегка обрабатывают раствором фермента трипсина или хелатона - версена, что приводит к его диссоциации, к полному разобщению клеток друг от друга. Затем такую взвесь отмытых клеток помещают в сосуд с питательной средой, где они опускаются на дно, прикрепляются к стеклу и начинают размножаться, образуя сначала колонии, а затем сплошной клеточный пласт. Так растут однослойные клеточные культуры, очень удобные для прижизненных наблюдений. Лучше всего для получения первичных культур из тканей животных использовать эмбриональный материал; культуры из клеток взрослых организмов растут очень плохо.

При культивировании клеток вне организма кроме смены среды важно поддерживать и необходимую температуру (около 20^о для хладнокровных и около 37^о для теплокровных). Обязательным условием культивирования клеток является соблюдение стерильности. Существует целый ряд длительно культивируемых клеток; это специальные клеточные штаммы, приспособившиеся десятилетиями к росту вне организма. Большей частью это клетки опухолевого происхождения или значительно измененные клетки, приобретшие свойства опухолевых клеток.

Сейчас метод культивирования клеток вне организма широко используется не только для цитологических, но и для генетических, вирусологических и биохимических исследований.

В культуре можно выращивать и растительные клетки. Для этого кусочки ткани обрабатываются ферментами, растворяющими клеточные оболочки. Отделившиеся клеточные тела, протопласты, помещают в культуральную среду, где они делятся и образуют зоны размножившихся клеток.

Наблюдения за живыми клетками обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроскопу. Живые клетки можно снимать и на кинопленку. В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку (цейтраферная киносъемка), можно подробно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, биение ресничек и т.д.

Теперь с развитием компьютерных технологий с помощью специальных телекамер возможно получать изображение клеток прямо на мониторе компьютера, записывать их в памяти компьютера, всячески обрабатывать и получать отпечатки на принтерах цветных или черно-белых. Так же возможно использовать такую компьютерную видеотехнику для цейтраферной съемки подвижных объектов.

При исследовании живых клеток используют методы микрохирургии, оперативного воздействия на клетки. С помощью прибора микроманипулятора клетки разрезают, извлекают из них части, вводят вещества (микроинъекция) и т.д. Микроманипулятор совмещается с обычным микроскопом, в который наблюдают за ходом операции. Микрохирургическими инструментами служат стеклянные крючки, иглы, капилляры, которые имеют микроскопические размеры и изготовляются на специальных приспособлениях – «микрокузницах». При микроманипуляциях клетки помещают в специальные камеры, в которые вводят также инструменты. Так, с помощью микроманипулятора удалось пересадить ядра от одного штамма амебы другому и доказать, что именно клеточное ядро определяет физиологические особенности клетки в целом. С помощью микроманипулятора удалось инъецировать в клетку амебы коллоидное золото, а затем исследовать распределение его частиц в цитоплазме и ядре.

С помощью таких микрохирургических инструментов можно поворачивать в клетках митотические веретена, оттаскивать отдельные хромосомы, вводить в живую клетку меченые антитела или разные белковые молекулы. Кроме механического воздействия на клетки в микрохирургии в последнее время широко применяют микропучки ультрафиолетового света или лазерные микропучки. Это дает возможность практически моментально инактивировать отдельные участки живой клетки. Так, например, можно инактивировать одно из ядрышек и следить за судьбой второго, интактного. В этом случае показано, что второе ядрышко принимает на себя дополнительную нагрузку и «работает за двоих». С помощью микропучков удается поразить часть митотической хромосомы или участок веретена деления. Оказалось, что поражение центромеры хромосомы выводит последнюю из процесса расхождения хромосом к полюсам клетки во время митоза. Недавно стали применять аппараты с лазерным микролучом, что позволяет очень точно дозировать количество энергии в точке поражения и использовать очень короткие (наносекунды) импульсы облучения.

При изучении живых клеток пытаются их окрашивать с помощью так называемых витальных красителей. Это красители кислой (трипановый синий, литиевый кармин) природы, применяемые при очень большом разведении (1: 200000), следовательно, влияние красителя на жизнедеятельность клетки минимальное. При окрашивании живых клеток краситель собирается в цитоплазме в виде гранул, а в поврежденных или мертвых клетках происходит диффузное окрашивание цитоплазмы и ядра.

При изучении живых клеток широко используют флуоресцирующие красители и метод флуоресцентной микроскопии. Суть его заключается в том, что целый ряд веществ обладает способностью светиться (флуоресцировать, люминесцировать) при поглощении ими световой энергии. Спектр флуоресценции всегда смещен в сторону больших длин волн по отношению к возбуждающему флуоресценцию излучению. Так, например, выделенный хлорофилл при освещении в ультрафиолетовых лучах светится красным цветом. Этот принцип используется в флуоресцентной микроскопии: рассматривание флуоресцирующих объектов в зоне коротких длин волн. Обычно в таких микроскопах применяются фильтры, дающие освещение в сине-фиолетовой области. Существуют ультрафиолетовые люминесцентные микроскопы.

Собственной флуоресценцией обладают некоторые пигменты (хлорофиллы, бактериальные пигменты), витамины (А и В₂), гормоны. Если во флуоресцентный микроскоп рассматривать клетки растений, то на темно-синем фоне будут видны ярко светящиеся красные зерна внутри клетки – это хлоропласты.

Можно применять метод флуоресцентной микроскопии, добавляя живым клеткам флуорохромы (флуоресцирующие вещества). Этот способ сходен с витальным окрашиванием в том смысле, что здесь также используют очень низкие концентрации красителя (1 х 10^-4–1 х 10^-5). Многие флуорохромы избирательно связываются с определенными структурами клетки, вызывая их вторичную люминесценцию. Так, например, флуорохром акридиновый оранжевый избирательно связывается с нуклеиновыми кислотами. Причем, связываясь в мономерной форме с ДНК, он флуоресцирует зеленым цветом, а в димерной форме с РНК светится красным цветом. Наблюдая за живыми клетками, окрашенными акридиновым оранжевым, видно, что их ядра имеют зеленый цвет свечения, а цитоплазма и ядрышки святятся красным цветом. Тем самым в живой клетке с помощью этого метода можно видеть локализацию (а в некоторых случаях рассчитывать количество) тех или иных химических веществ. Существуют флуорохромы, избирательно связывающиеся с липидами, слизью, кератином и др.

В живые клетки можно инъецировать также меченые флуорохромами антитела. Так, например, введенные в клетку связанные с флуорохромом антитела к белку тубулину соединяются с микротрубочками, которые теперь можно наблюдать в живых клетках с помощью флуоресцентного микроскопа.

В последнее время начинает широко использоваться для изучения живых клеток или их компонентов сочетание световой микроскопии (особенно фазовоконтрастной) с электроннно-компьютерной обработкой изображения. При этом используется видеозапись с электронной обработкой изображения, которая как бы «убирает» фоновые уровни и выделяет, контрастирует наблюдаемые структуры. Такая методика позволяет на телеэкране видеть такие структуры как микротрубочки, размер которых (20 нм) намного меньше разрешающей силы светового микроскопа. Применение таких систем не только заменяют цейтраферную киносъемку, вместо которой используется видео-запись, но и позволяет компьютерную обработку изображения: сведения о плотности структур, о их параметрах, числе и трехмерной организации. В сочетании с флуоресцентной микроскопией эти методы открывают огромные перспективы в изучении живых клеток.

Обычные методы световой микроскопии трудно использовать для воспроизведения трехмерной картины изучаемого объекта из-за небольшой глубины резкости микроскопа. Обычно клетки рассматриваются как оптические разрезы на данной глубине фокуса. Для того, чтобы получить полную трехмерную реконструкцию объекта используют специальный конфокальный сканирующий световой микроскоп. С помощью этого прибора получают серии последовательных оптических срезов, взятых с различной глубины и изображения которых накапливаются в компьютере, и по специальной программе реконструируется трехмерное, объемное, изображение объекта. Обычно используются объекты, окрашенные флуорохромами.