Механизмы генной регуляции у про- и эукариот. Экспрессия генов.

Генетические механизмы экспрессии генов были изучены у микроорганизмов французскими генетиками Ф. Жакобом и Ж. Моно.

Главное положение этой теории состоит в том, что в ДНК имеются следующие типы генов:

1) структурные – последовательность их нуклеотидов кодирует структуру синтезируемых клеткой макромолекул (полипептидов, белков, р-РНК, т-РНК);

2) функциональные или акцепторные – последовательность их нуклеотидов не имеет кодирующей функции, но с помощью присоединения к ним разных белковых факторов управляют работой структурных генов. К ним относят: регуляторы, операторы, модификаторы.

3) Транспозоны – это мобильные генетические элементы (мобильные ДНК, подвижные гены).

Мобильные генетические элементы – это мобильные последовательности ДНК, найденные в геномах всех организмов. Во многих геномах они находятся в изобилии: например, они составляют до 50% человеческой ДНК. Большинство транспозонов способны встраиваться в различные участки ДНК. Они часто вызывают мутации, либо включаясь в другой ген и нарушая его нуклеотидную последовательность, или вызывая перестройки ДНК, такие как делеции, дупликации и инверсии.

Мобильные элементыбывают автономными и неавтономными. Среди автономных, одни из них имеют только те последовательности, которые необходимы для их собственного перемещения, тогда как другие – имеют сложную структуру и кодируют ряд функций, не связанных непосредственно с перемещением. Неавтономные транспозоны для транспозиции нуждаются в ферментах, кодируемых автономными транспозонами.

У человека транспозоны были обнаружены в 1991, когда Фрэнсис Коллинз и его коллеги обнаружили 31-летнего человека с нейрофиброматозом, вызванным перемещением последовательности Alu. Нейрофиброматоз – болезнь, которая вызывает многочисленные опухоли кожи и нервов. В настоящее время установлено, что от 45 до 50% (по данным разных авторов) человеческого генома состоят из последовательностей, происходящих от мобильных элементов, хотя большинство этих элементов является бездействующими и не способны к перемещению. Из них, около 2% – это ДНК транспозоны и приблизительно 42% – ретротраспозоны.

Эволюционное значение мобильных генетических элементов неизвестно, но были предложены три гипотезы, объясняющие их происхождение. Гипотеза «клеточной функции» предполагает, что мобильные элементы обеспечивают какую-то важную функцию клетки. Гипотеза «генетической изменчивости» предполагает, что мобильные элементы, вызывая мутации, обеспечивают эволюционную гибкость видов. Гипотеза «эгоистичной ДНК» предполагает, что мобильные элементы не приносят какую-либо пользу клетке, но широко распространены из-за того, что они могут копироваться и распространяться.

Один или несколько структурных генов, расположенных в бактериальной или вирусной «хромосоме» рядом с группой регуляторных генов, представляют вместе единицу генетической регуляции – оперон.

Принципы работы оперона прокариот рассмотрим на примере работы оперона кишечной палочки (E. coli), ответственного за усвоение лактозы у этой бактерии (Рис 3).

активатор

промотор

оператор

терминатор

Рис. 3 — Структура лактозного оперона

Основу генетического аппарата кишечной палочки составляет бактериальная хромосома, входящая в состав нуклеоида. Нуклеоид этой бактерии включает различные участки, в том числе и лактозную область (lac оперон). Последняя область включает 3 гена, кодирующие 3 фермента: β‑галактозидазу, пермеазу и трансацетилазу (1, 2, 3), участвующих в метаболизме лактозы. Все гены laс оперона транскрибируются в одну и-РНК, которая транслируется с образованием 3-х белков.

Оперон начинается с участка, к которому присоединяется особый белок-активатор – Сар-белок, активизирующий катаболические гены. Без этого белка фермент РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию. Сар-белок предварительно активизируется сам присутствующим в клетке циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). Вслед за этим участком лежит промотор. Это последовательность нуклеотидных пар, опознаваемая РНК-полимеразой. РНК-полимераза прикрепляется к промотору и затем продвигается вдоль оперона, транскрибируя его. За промотором находится оператор, состоящий из 21 пары нуклеотидов, который играет важную роль в регуляции работы оперона, так как с ним может связываться особый белковый фактор – регуляторный белок. Заканчивается laс оперон терминатором – небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона.

Основная регуляция работы структурных генов laс оперона осуществляется регуляторным белком, который кодируется геном-регулятором. Этот белок синтезируется в клетке непрерывно, но в очень небольшом количестве (одновременно в цитоплазме присутствует не более 10 молекул). Регуляторный белок обладает сродством с оператором laс оперона, и если в питательной среде нет лактозы, то прикрепляется к оператору и препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, которые оказываются репрессированными. Синтез кодируемых ферментов не идет. При поступлении в питательную среду лактозы регуляторный белок связывается с лактозой раньше, чем его молекулы достигнут оператора и сильно изменяет свою структуру, вследствие чего теряет способность присоединяться к оператору. РНК-полимераза свободно продвигается по оперону, транскрибирует структурные гены и в клетке начинается синтез всех трех ферментов, необходимых для усвоения лактозы, т.е. происходит индукция (экспрессия гена). При этом типе регуляции экспрессии генов лактоза выполняет роль эффектора – низкомолекулярного вещества, изменяющего свойства белка при соединении с ним.

Регуляция активности генов у эукариот изучена менее полно, чем у вирусов и прокариот, что обусловлено наличием у них ядра, сложно устроенных хромосом и дифференциацией клеток. Допускается, что в основе регуляции действия генов у эукариот лежат механизмы, в принципе сходные с таковыми у вирусов и прокариот. Однако, есть и существенные отличия.

1) Почти всегда оперон эукариот содержит только один структурный ген в то время как у вирусов и прокариот в большинстве оперонов их бывает несколько, иногда более десятка.

2) У эукариот структурные гены, ответственные за разные звенья той или иной цепи биохимических реакций, как правило, разбросаны по геному, а не сосредоточены в одном опероне, как это часто имеет место у прокариот.

3) У эукариот существует одновременное групповое подавление активности генов во всем ядре, в целой хромосоме, или в большом ее участке. Такая групповая репрессия генов осуществляется в значительной мере гистонами – белками, входящими в состав эукариотических хромосом. Пример групповой регуляции активности генов – это полное прекращение транскрипции всех генов при сперматогенезе.

4) Существует система регуляции с помощью стероидных гормонов. Последние связываются со специальными белками-рецепторами, расположенными в мембранах клеток-мишеней. Синтез белков-рецепторов контролируется геном тестикулярной феминизации Х хромосомы. Такой комплекс обеспечивает активацию определенного гена.

5) Транскрипция и трансляция у эукариот разобщены (у прокариот – сопряжены): синтез и-РНК происходит в ядре, а белков – в цитоплазме на рибосомах. Без гормонального сигнала, некоторые и-РНК остаются не транслированными.

Примером сложной экспрессии генов может служить генный контроль синтеза гемоглобинов у человека. Известно, что гемоглобин человека является тетрамером, то есть состоит из четырёх субъединиц. У взрослого человека они представлены парными полипептидными цепями. Каждая цепь контролируется определенным генным локусом (Табл. 1).

Таблица 1 — Генный контроль синтеза гемоглобинов у человека

Вид Hb	Полипептидные цепи	Генные локусы
HbА HbА2 HbF Hbs	2α, 2β 2α, 2σ 2α, 2γ 2α, β, β^6-^вал	α^А, β^А α^А, σ^А^2 α^А, γ^F α^А, β^А'

НbА и НbА₂ относятся к нормальным гемоглобинам человека. В эритроцитах плода около 80% гемоглобина представлено формой НbF, его молекула состоит из двух цепей α и двух цепей γ. У больных серповидноклеточной анемией имеется особый гемоглобин Нbs, который отличается от нормального НbА тем, что у него в одной β цепи в 6-ом положении глутаминовая кислота заменена валином. Существует мутантная форма гемоглобина – НbC. В нем в 6-ом положении глутаминовая кислота заменена лизином. Этот вариант гемоглобина назван «С» по названию города, у жителя которого была впервые обнаружена мутация – Christchurch (Новая Зеландия), хотя встречается преимущественно в Западной Африке.

Четыре типа гемоглобинов контролируются отдельными генами:

- локус α^А определяет формирование α цепей в течение всей жизни у всех четырех гемоглобинов;

- локус β^А контролирует формирование β цепей только в НbА после рождения;

- локус γ^F определяет синтез γ цепи в гемоглобине НbF в течение внутриутробной жизни;

- локус σ^А2 определяет синтез σ цепей в гемоглобине НbА₂ в течение всей жизни после рождения.

Локусы α^А, β^А, σ^А2, γ^F тесно сцеплены в хромосоме. Все четыре указанных генов – структурные. В их действии имеется сложная экспрессия, благодаря чему возникают четыре типа гемоглобинов.

Экспрессия генов β^А, σ^А2 находится под влиянием генов-регуляторов. У взрослого человека происходит замена НbF плода на НbА или НbА₂.

При этом происходит репрессия гена γ^F и включение гена β^А. Взаимодействие генов α^А, β^А, σ^А2 определяет развитие нормального гемоглобина и является примером межгенного взаимодействия.

При формировании гемоглобина серповидноклеточной анемии наблюдается межаллельное взаимодействие аллели β^А и ее патологической аллели.

Вышеизложенные данные позволили сформулировать современную теорию гена, которая утверждает:

1. Ген занимает определенный локус в хромосоме.

2. Ген – часть молекулы ДНК; число нуклеотидов в гене неодинаково.

3. Внутри гена может происходить рекомбинация и мутация.

4. Существуют структурные и функциональные гены.

5. Структурные гены контролируют синтез полипептидов, т-РНК и р‑РНК.

6. Функциональные гены контролируют деятельность структурных генов.

7. Расположение триплетов в структурных генах коллинеарно последовательности аминокислот в полипептиде.

8. Генотип, будучи дискретным, функционирует как единое целое.

Генная инженерия.

Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который приблизился к рубежу практических приложений, является генная инженерия. Генная инженерия – это сумма методов, позволяющая переносить гены из одного организма в другой, или – это технология направленного конструирования новых биологических объектов (С.И. Алиханян, 1980 г.). К генной инженерии принято относить следующие операции:

1) Синтез генов вне организма.

2) Выделение из клеток отдельных генов или генетических структур (фрагментов хромосом, целых хромосом, ядер).

3) Направленную перестройку выделенных структур.

4) Копирование и размножение выделенных генов или синтезированных генов или генетических структур.

5) Перенос и включение таких генов или генетических структур в подлежащий изменению геном.

6) Экспериментальное соединение геномов в одной клетке.

Для того, чтобы организм обладал новыми наследственными свойствами необходимо ввести в него новый ген, подключить его к регуляторной системе организма, добиться его функционирования в соответствующих клетках. Существует 3 этапа такого процесса: получение генетического материала, введение генетического материала в изменяемый организм и включение новых генов в генетический аппарат клетки.

1. Получение генетического материала.

Осуществляется путем его выделения из генома клеток донора, либо путем его синтеза химическим путем или с помощью и-РНК и фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Нужный ген получают путем вырезания его из ДНК с помощью особых ферментов – рестриктаз. Такой способ был разработан на плазмидной ДНК бактерий.

2. Введение генетического материала.

Осуществляется путем трансформации, трансдукции, конъюгации и соматической гибридизации.

Гибридизация соматических клеток приводит к слиянию двух протопластов клеток и образованию ядра с диплоидным набором хромосом. Затем гибридная клетка делится, и образуются дочерние гибридные клетки с признаками обоих родителей.

3. Включение новых генов в генетический аппарат клеток.

Новые введенные гены не способны к самостоятельной репликации. Поэтому они вначале вводятся в состав структуры, способной к воспроизведению. Она называется вектором. Это молекула ДНК, которая способна переносить в клетку чужой ген и обеспечивать его размножение там. Векторами могут быть плазмиды бактерий, бактериофаги, вирусы животных, космиды – фрагменты бактериофагов с плазмидами.

С помощью генной инженерии решено ряд проблем биологии: установлено мозаичное строение гена, расшифрована структура генов, кодирующих иммуноглобулины. В 1980 году получен гормон соматотропин, в 1982 – инсулин методом генной инженерии, а также интерферон, витамины, и различные гормоны. Генная инженерия является основой биотехнологии, а в медицине обеспечивает производство вакцин, сывороток, а также диагностику генетических аномалий человека на ранних стадиях развития (генная хирургия – замена поврежденного гена новым).

В 2001 году усилиями генетиков программы «Геном человека» открыто количество генов, составляющих 31 тыс. на геном человека. Это расширяет возможности использования генетики для медицинских целей.

Все работы по клонированию человека, по мнению большинства ученых-генетиков должны быть запрещены.

Пересадка генов должна проводиться для человека только в терапевтических целях, с помощью соматических клеток. Применение половых клеток для генной терапии возможно только при достаточном доказательстве безопасности такого лечения по сравнению с генной терапией соматическими клетками.