Способность сыворотки крови пациентов С сиалоденитами разрушать матрикс биопленки

 

Гончарова А.И.(аспирант кафедры клинической микробиологии), Корнеева Д.Е.(студентка 3 курса стоматологического факультета)

Научный руководитель: к.м.н., доцент Окулич В.К.

 

УО «Витебский государственный медицинский университет»,

г. Витебск

 

Актуальность. Биопленка – микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов [1]. Характерное свойство всех БП – их поразительная устойчивость к физическим и биохимическим воздействиям, включающим антибиотико-резистентность [2]. В пределах БП могут происходить физиологические изменения, включающие реакцию общего стресса, закрытие ключевых метаболических процессов и индукцию защитных механизмов [3]. Популяция клеток в составе БП гетерогенна, содержит быстро- и медленнорастущие бактерии. Ряд из них устойчивы к антибиотикам за счет экспрессии инактивирующих ферментов, другие – не экспрессируют подобные системы. Возросший интерес к БП привел к тому, что биопленочные микробы часто воспринимаются как объекты, абсолютно недосягаемые для эффекторов иммунной системы. Некоторые авторы высказывают мнение о том, что микробные биопленки могут блокировать начальные этапы воспаления [4].

Клетки микробов в составе БП менее доступны для фагоцитоза, чем планктонные клетки. Свойство большей устойчивости бактерий в составе БП к фагоцитозу подтверждается тем, что прослеживается в реакциях фагоцитов с биопленками различного происхождения. Главную причину снижения эффективности фагоцитоза биопленочных бактерий связывают с антифагоцитарным влиянием структур внеклеточного матрикса БП [5]. Учитывая вышесказанное, представляется важным оценить способность сывороток крови разрушать экзополимерный матрикс биопленок. Можно предположить, что низкая способность сыворотки крови разрушать экзополимерный матрикс играет существенную роль в патогенезе заболеваний.

Цель. Оценить способность сывороток крови пациентов с сиалоаденитами к разрушению экзополимерного матрикса биопленок S. aureus.

Материалы и методы. Было обследовано 18 пациентов с сиалоаденитами. Контрольную группу составили практически здоровые люди – доноры станции переливания крови. Кровь у пациентов забиралась натощак с 8 до 9 часов утра из локтевой вены, центрифугировалась со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 10 мин.

Для оценки способности сывороток крови расщеплять экзополимерный матрикс биопленки использовали разработанный на кафедре клинической микробиологии метод.

В стерильную чашку Петри с агаром Мюллера – Хинтона помещали стерильную инертную полимерную мембрану, прижимали стеклянным грузом и вносили 0,5 мл взвеси S. Aureus или в концентрации КОЕ/мл и 5 мл 0,9% NaCl. Чашку Петри инкубировали в течение 3 сут. при температуре 37 °С. Мембрану извлекали из чашки Петри, биопленку с мембраны смывали стерильным физиологическим раствором. К полученной суспензии добавляли в избытке 0,5% раствор Конго красного. Суспензию дважды отмывали 0,9% NaCl для удаления не связавшегося Конго красного с осаждением матрикса центрифугированием при 1000 оборотов в мин. (200 g) в течение 75 мин. после каждой отмывки. Суспензию замораживали и хранили при –25 °С до использования. Для приготовления рабочей суспензии матрикса биопленки разводили размороженную суспензию матрикса раствором 0,9% NaCl до оптической плотности 2,5 Еоп на многоканальном спектрофотометре при длине волны 492 нм и 0,15 мл суспензии матрикса в лунке 96-луночного планшета для ИФА. Далее 0,1 М раствором фосфатного буфера с pH 7,4 доводили оптическую плотность суспензии до 2 Еоп. В 1 мл рабочей суспензии содержалось 12,2 мг сухого матрикса и 0,1 мг Конго красного. В качестве консерванта в суспензию добавляли азид натрия до концентрации 2 мг/мл. Реакцию ставили в пробирках типа эппендорф. Реакционная смесь состояла из 0,1 мл исследуемого агента и 0,3 мл рабочей суспензии экзополимерного матрикса биопленки. Сыворотки брали в 10-кратном разведении на 0,9% NaCl. После инкубации в течение 24 ч при 37 °С реакционную смесь центрифугировали 10 мин. при 10 тыс. оборотов в мин. (7930 g) на центрифуге MIKRO 120 (Hettich) для осаждения не разрушенных компонентов матрикса и переносили по 0,15 мл надосадка в лунки планшета для иммуноферментного анализа. Далее производили учет результатов реакции по увеличению оптической плотности надосадка на многоканальном спектрофотометре Ф300 ТП при длине волны 492 нм в сравнении с отрицательными контрольными пробами, где вместо раствора исследуемого препарата использовали 0,9% NaCl.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программ Statistica 6, Statgraphics Plus. Для определения достоверности отличия групп использовался критерий Стьюдента. Предварительно определялась нормальность распределения данных внутри групп: в случаях, когда ассиметрия и эксцесс внутри групп по модулю не превышали 2, считали, что распределение приближается к нормальному.

Результаты исследования. При исследовании способности сывороток крови разрушать экзополимерный матрикс биопленки S. aureus оказалось, что она была достоверно (p<0,005) ниже у пациентов с сиалоаденитами (0,231 ±0,009, n=18), чем у доноров (0,309±0,012, n=21).

Выводы. Выявлено, что сыворотки крови пациентов с сиалоаденитами обладают значительной способностью расщеплять экзополимерный матрикс биопленок, образованных S. aureus. При этом у пациентов с воспалительными заболеваниями больших слюнных желез эта способность достоверно ниже, чем в группе практически здоровых людей.

 

„ Литература:

1. Donlan R.M., Costerton J.W. (2002) Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms Clinical Microbiology Reviews. 2002; 15 (2):167–193.

2. Stewart P.S., Costerton J.W. (2001) Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet. 2001; 358: 135–138.

3. Mah T.-F.C., OToole G.A. (2001) Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 2001; 9:34–39.

4. Dongari-Bagtzoglou A. (2008) Pathogenesis of mucosal biofilm infections: challenges and progress. Exp. Rev. Anti. Infect. Ther. 2008; 6 (2): 201–208.

5. Kropec A., Maira-Litran T., Jefferson K.K. et al. (2005). Poly-N-acetyl-glucosamine production in Staphylococcus aureus is essential for virulence in murine models of systemic infection. Infect. Immun. 2005; 73 (10): 6868–6876.