Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.

Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида. Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;2) определения возбудителя, выделенного от больного;3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

 

 

Билет №13

 

Методы микроскопии (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная).

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Осно­вана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воз­действия на них каких-либо источников энергии: световых, элек­тронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесцен­ция — люминесценция объекта под влиянием света. Если осве­щать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В ре­зультате возникает цветное изображение объекта. Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зре­ния основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в био­логическом микроскопе.

Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объек­та на темном фоне.Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способно­сти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмик­роскопических объектов.

Реакция пассивной гемагглютинации. Компоненты. Применение.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использова­нии эритроцитов (или латекса) с адсорбиро­ванными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соот­ветствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеива­ние и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. Компоненты. Для постанов­ки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавли­вают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Ад­сорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома.

Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микро­организмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества.Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обла­дающие высокой адсорбирующей активностью. Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гор­мона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительнос­ти к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях. Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфич­ностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для иденти­фикации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токси­нов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные анти­тельные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфи­ческих антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии на­груженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности.Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отри­цательной реакции появляется осадок в виде компактного.диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — харак­терный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неров­ными краями.

 

Билет №14

1.Структура и химический состав бактериофага. Бактериофаги -группа вирусов, паразитирующих в бактериальных клетках. Внешне большинство бактериофагов напоминают сперматозоиды или головастиков, но среди них встречают и другие формы. Структура бактериофага:1)нуклеиновая кислота 2)головка бактериофага 3)полипептидные субъединицы(кубический тип) 4)полый стержень 5)отросток 6)полипептидные еденицы 7)чехол(сокращается) 8)шестиугольная базальная пластинка 9)зубцы, нити. Головка Т-фагов образована из однотипных субъединиц, организованных по принципу кубической симметрии, и может достигать размеров 100 нм. Капсомеры головки состоят из белковых молекул, построенных преимущественно из аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также лизина. Содержание белка и ДНК в головке примерно одинаково. Геном большинства фагов образует спирально упакованная двойная нить ДНК. Число фагов, содержащих одноцепочечную молекулу ДНК или РНК, незначительно. У некоторых фагов (например, Т2) в головке находится внутренний белок, содержащий полиамины (спермин и путресцин) и обеспечивающий суперспирализацию большой молекулы ДНК. В таком виде она может упаковываться сравнительно небольшом объёме. В составе фаговой ДНК обнаружены необычные азотистые основания (например, оксиметилцитозин). Хвост Т-фагов Он включает поль - стержень (сконструирован по принципу спиральной симметрии) и сократительный чехол, присоединяющийся к воротничку, окружающему стержень около головки. Чехол образован 120-140 белковыми молекулами, каждая из которых связывает одну молекулу АТФ и ионы Са2+. В дистальном отделе стержня расположена шестиугольная базальная пластина с шестью шипами шестью нитями (фибриллами). У чётных фагов (например, у Т2) окончания фибрилл опущен вниз, а у нечётных — загнуты вверх. У некоторых Т-фагов в дистальной части хвоста находит лизоцим (эндолизин).

 

2.Аутоиммунные процессы. Различают аутоиммунные реакции и аутоиммунные заболевания, в основе которых лежит взаимодействие компонентов иммунной системы с собственными здоровыми клетками и тканями. К аутоиммунным заболеваниям иногда относят и болезни иммунных комплексов.Аутоиммунные реакции наблюдаются в норме у здоровых лиц, а также при патологии. В первом случае они протекают непрерывно, и их действие сводится к удалению отмирающих, стареющих, больных, модифицированных какими-либо воздействиями клеток. Они являются начальным компонентом развертывания иммунного ответа на различные антигены. Эти реакции полезны для организма и не перерастают в болезнь.Аутоиммунные болезни, или аутоаллергия, встречаются реже. В основе этих патологических состояний лежат аутоиммунные реакции с забарьерными перекрестно реагирующими антигенами, образование «запретных» клонов иммунокомпетентных клеток, реагирующих с собственными нормальными тканями, генетически запрограммированная слабость иммунного ответа на конкретный антиген, недостаточность Т-супрессоров, блокада рецепторов лимфоцитов и другие причины. Они могут быть также следствием приема лекарственных препаратов.Аутоиммунные заболевания бывают органоспецифическими, неорганоспецифическими и смешанными. К органоспецифическим относят болезни, при которых аутоантитела специфичны к одному или группе обладающих антигенными свойствами структурных элементов клеток и тканей одного органа. Чаще всего это забарьерные антигены, врожденная толерантность к которым отсутствует, например, в случае тиреоидита Хашимото, первичной микседемы, тиреотоксикоза, пернициозной анемии и др. К органонеспецифическим заболеваниям относятся патологические процессы, при которых аутоантитела реагируют, как указывалось, со структурными элементами клеток и тканей данного или даже другого организма, имеющего перекрестные антигенные структуры, примером которых могут служить антинуклеарные антитела при системной красной волчанке, ревматоидном артрите. Смешанные болезни включают оба вышеперечисленных механизма.Довольно часто можно обнаружить нормальные аутоантитела, не вызывающие видимых симптомов заболевания. Они встречаются у совершенно здоровых людей, например, ревматоидный и антинуклеарные факторы. Довольно трудно бывает доказать, что видимая клиническая картина заболевания представляет собой следствие аутоиммунного процесса. Обнаружение антител к аутоантигенам еще не позволяет сделать вывод о причинно-следственной связи заболевания с аутоиммунными реакциями. Для подтверждения этого необходимо: выявить иммунный ответ на аутоантиген, имеющий отношение к заболеванию; идентифицировать его; пассивно перенести заболевание и спровоцировать болезнь соответствующим антигеном в эксперименте на животных.

 

 

Билет № 15.