Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Критерии чувствительности (мик, мбк).

Критерий чувств-ти микробов к антибиотикам-это их конц. В сыворотке крови и др. Биотопах микроорг. После введения среднетерапевтических и высших доз препаратов

Минимальная концентраця - мера чувствительности микробов, т.е. конц, которая подавляет рост микробов на питательных средах в стандарт. условиях.

Критерии оценки чистых культур:

1. МИК//МПК-минимальная ингибирующая конц.//мин. подавляющая конц.-наиб. Разведение препарата, тормозящее рост культуры в стандарт усл.
2. МИК50-в данной конц. антибиотка чувств-но 50% исследуемых штаммов.
3. МИК90- «_» 90% «_»
4. МБК- мин. бактериальная конц.- мин. конц. антимикроб. Препарата, вызывающего полную гибель бактерий в стандарт. усл.

Для антибиотиков аминогликозидов, фторохинолов, амфотерицинаВ характерен доза-зависимый эффект-микроогрг. элиминируются быстрее, когда конц. антибиотика выше МИК для возбудителя.

Для в-лактамных антибиотиков, гликопептидов характ. Время-зависимый эффект.

Клас. бакт. по степени чувств-ти.

1. Чувтвительные-подавляются конц. препатарата среднетерапевтической дозы.
2. Умерено чувств-ые- «_» максимальной дозы.
3. Устойчивые//резистентные-рост не подавляется даже при введени макс. кол-ва препарата.

 

Принципы определения чувствительности микроорганизмов

1. Диффузия препарата в агар из бумажных дисков//полосок//лунок
2. Серийные разведения в бульоне//плотной пит среде.

 

ДИФФУЗИОННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ (ДИСКОДИФФУЗИОННЫЙ МЕТОД И Е-ТЕСТ).

Диффузионный метод основан на регистрации диаметра зоны ингибиции (задержки) роста исследуемого микроорганизма. Метод менее чувствителен и менее точен, чем метод стандартных разведений, но на практике применяется чаще из-за своей простоты. Следует помнить, что скорость диффузии в агаре любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды.

Метод бумажных дисков (дискодиффузионный метод).

Метод наиболее прост и широко используется в клинической практике. Образование зоны ингибиции роста происходит в результате диффузии антибиотиков из носителя (диска) в питательную среду (рис. 11). В определенных пределах величина диаметра зоны ингибиции роста жестко связана с величиной МИК. Метод позволяет лишь косвенно судить о величине МИК. Основным результатом является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности.

Для проведения этого метода используют стандартные диски, содержащие определенное количество антибиотиков, и стандартную питательную среду, необходимую для роста данного вида микроорганизма. Из суточной микробной культуры готовят взвесь на физиологическом растворе (1 млрд. микробных тел в 1 мл) и разводят ее в 10 раз. На поверхность чашки с плотной средой наносят 1 мл микробной культуры и покачиванием чашки или стерильным шпателем равномерно распределяют ее по всей поверхности среды. Остаток удаляют пипеткой или сливают в дезинфицирующий раствор. Среду подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски с антибиотиками (не более 6 на чашку диаметром 10 см) на расстоянии >1,5 см друг от друга и от краев чашки. Условия инкубации зависят от вида микроорганизма (для большинства видов – в термостате при 37оС 24 часа).

Учет проводят в падающем свете на фоне темной поверхности, измеряя диаметр зоны задержки роста (с учетом диаметра диска). Оценку результатов проводят по специальной таблице (обычно прилагается к набору дисков для определения чувствительности к антибиотикам) путем сопоставления диаметра зон задержки роста испытанной культуры с пограничными значениями диаметра зоны в таблице. Исследуемую культуру относят к одной из трех категорий: чувствительная, умеренно-чувствительная и устойчивая.

Описанный метод является полуколичественным. Для получения количественных результатов используют методы серийных разведений.

Е-тест (E-test или эпсилометрический метод).

Метод близок по технологии постановки к методу бумажных дисков. В качестве носителя используется узкая полоска полимера (0.5х6.0 см), пропитанная различными концентрациями антибиотиков (от минимальных до максимальных). Ингибиция роста микроорганизма вокруг полоски носителя происходит в зоне, где концентрация антибиотиков, диффундирующего из носителя, выше МИК (рис. 12). Концентрации антибиотиков нанесены на соответствующем отрезке поверхности носителя. Величину МИК учитывают в том месте, где граница зоны ингибиции роста вплотную подходит к носителю. Е-тест сочетает простоту постановки метода бумажных дисков и точность метода серийных разведений.

 

 

МЕТОДЫ СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ.

Позволяют количественно оценить чувствительность выделенного микроба к антибактериальным средствам и определить МИК препарата. Методы серийных разведений основаны на прямом определении величины МИК. Для определения величины МИК заданные концентрации антибиотиков вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма. После инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают метод серийных разведений в бульоне, метод серийных разведений в агаре.

В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют также методы серийных макро – и микроразведений.

Разновидностью метода серийных разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций антибиотиков или даже одной концентрации, соответствующих пороговым (то есть концентрациям, отделяющим чувствительные микроорганизмы от промежуточных и промежуточные от резистентных). Метод обеспечивает получение качественных результатов, позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к определенной категории чувствительности, и часто используется в коммерческих тест-системах.

Метод серийного разведения антибиотика в питательной среде (бульоне).

Первоначально готовят основной раствор, содержащий определенную концентрацию антибиотиков в специальном растворителе. Из него готовят ряд убывающих разведений антибиотиков в пробирках с бульоном (чаще двухкратные) и добавляют испытуемую культуру (обычно 10⁵-10⁶ бактериальных клеток). Контролем служит пробирка с бульоном и культурой без антибиотиков. Сроки инкубации зависят от вида микроорганизма (чаще сутки). Определяют МИК, которая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста (прозрачная питательная среда). Для определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) из нескольких последних пробирок с задержкой роста делают посев петлей на сектора чашки Петри. За МБК, которая, как правило, на несколько разведений меньше МИК, принимают концентрацию препарата в последней пробирке, посев из которой не дал роста.

Метод серийных разведений в плотной питательной среде.

Этот метод более чувствителен и точен, чем метод бумажных дисков. Каждый антибиотик испытывают, как правило, в трех концентрациях (исходя из уровней чувствительности микроорганизмов), которые добавляют к расплавленному и охлажденному агару. Агар с антибиотиками разливают в чашки Петри. Контролем служит чашка с агаром без антибиотиков. Посев производят петлей или лучше штампом-репликатором, который позволяет одновременно определить чувствительность к трем концентрациям антибиотиков 25-50 культур (в зависимости от числа лунок в штампе). Учет роста в термостате осуществляют спустя сутки. Культура считается чувствительной, если на месте посева нет роста ни одной колонии.

Оценка результатов:

- чувствительные культуры – их рост подавлен всеми тремя концентрациями (можно применять антибиотики в средней терапевтической дозе);

- среднечувствительные (можно применять антибиотики только в увеличенной дозе) – рост подавляют вторая и третья концентрация антибиотиков;

- умеренно-устойчивые подавляет только третья наиболее высокая концентрация (антибиотики применяют только местно);

- устойчивые (антибиотики применять нельзя по тестам in vitro) - растут на всех трех концентрациях.