Капсула бактерий, ее роль ,методы выявления .

Капсула – структура бактериальной клетки, которая расположена на поверхности клеточной стенки и тесно связана с ней. Она состоит из высокогидрофильных мицелл гетерополисахаридов (у кишечных бактерий), белков (у стрептококков), полипептидов (бацилл сибирской язвы). В зависимости от толщины слоя и прочности соединения с телом различают капсулу или макрокапсулу, которая видна в световом микроскопе, микрокапсулу (К-антиген), которая выявляется при электронной микроскопии, серологическими и химическими методами, и слизистый слой, который непрочно связан с клеточной стенкой и состоит из экстрацеллюлярных веществ микроба.

У некоторых бактерий капсула постоянна, содержится у всех особей и во всех средах (Klebsiella pneumoniae, S. pyogenes). У пневмококков, возбудителей сибирской язвы, C. perfringens капсульное вещество образуется только в макроорганизме, а на питательных средах синтез его прекращается. Капсула является важным фактором вирулентности, защищает бактерии от действия фагоцитов, связывает ионы тяжелых металлов, защищает от действия антител, комплемента и от высыхания. Определение капсулы используют для классификации и идентификации бактерий и установления их вирулентности. Капсула выявляется при специальных методах окраски (метод Бурри-Гинса), создающих негативное контрастирование вещества капсулы тушью.

 

СПОРЫ, ИХ ЗНАЧЕНИЕ, СТАДИИ ОБРАЗОВАНИЯ,УСЛОВИЯ ДЛЯ СПОРООБРАЗОВАНИЯ,СПОСОБЫ ВЫЯВЛЕНИЯ.

Споры – покоящиеся формы жизненного цикла бактерий, образуются внутри цитоплазмы вегетативных клеток в неблагоприятных условиях существования и обеспечивают сохранение вида. В спорах микробы находятся в состоянии анабиоза. Микробы, образующие споры, называются бациллами (аэробы) или клостридиями (анаэробные бактерии, имеющие форму веретена). Споры отличаются от вегетативной клетки тем, что происходит репрессия генома и клетка переходит в состояние анабиоза, при котором отсутствует обмен веществ, вода переходит из свободного состояния в связанное, повышается концентрация ионов кальция, появляется дипиколиновая кислота, которая обусловливает термоустойчивость споры.

Процесс спорообразования сходен у большинства бактерий. Вначале образуется дополнительный нуклеоид, который отходит к одному из полюсов клетки. Затем в ЦПМ образуется инвагинация, разделяющая клетку на 2 протопласта, каждый из которых содержит 1 хромосому. Меньший из протопластов – проспора (предспора) – покрывается второй оболочкой, которая синтезируется мембраной материнской клетки. В оболочке клетки содержится дипиколиновая кислота и ионы кальция. Далее между двумя листками мембраны формируется специфический для споры кортикальный слой (кортекс), состоящий из пептидогликана, который отличается по составу от пептидогликана клеточной стенки. Снаружи спора покрывается толстой рыхлой оболочкой – экзоспориумом, содержащей немного углеводов. Белковая оболочка споры богата остатками цистеина и лизина и обладает гидрофобностью. После этого наступает аутолиз вегетативной клетки.

При попадании споры в благоприятные условия происходит активация споры и ее прорастание в вегетативные клетки. Идет дерепрессия генома, мобилизация метаболических процессов, из клетки удаляется дипиколиновая кислота, ионы кальция, разрушается пептидогликан кортекса.

Прорастание спор включает три стадии: активацию, начальную стадию и стадию роста.

Активация является обязательным условием прорастания спор. Она осуществляется различными воздействиями: снижением рН, веществами, содержащими свободные сульфгидрильные группы, повышением температуры, механическим повреждением спор.

Начальная стадия: происходит активация автолизина, который разрушает пептидогликан кортекса, в спору поступает вода, выходит дипиколинат кальция.

Стадия роста. После разрушения кортекса и наружных слоев споры появляется вегетативная клетка, которая при наличии питательных веществ удваивает свою биомассу, делится на две дочерние клетки, которые далее активно размножаются. Процесс прорастания споры контролируется генами как спорового, так и вегетативного геномов.

Для обнаружения спор используют электронную микроскопию, а также специальный метод окраски по Ожешко, на первом этапе которого нефиксированный мазок обрабатывают в течение 1-2 минут 0,5% р-ром HCl при подогревании, а далее препарат окрашивают по методу Циль-Нильсена. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий. При простых методах окраски оболочка не пропускает красители, споры сильно преломляют свет и видны в микроскопе как прозрачные зерна.

 

ЖГУТИКИ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ПОДВИЖНОСТИ.ИНЖЕКТИСОМА,СТРОЕНИЕ,ФУНКЦИИ.

Жгутики – органы передвижения бактерий. Это тончайшие длинные нити (3-5х12-25 нм), одетые чехлом белковой природы, берут начало в цитоплазме и связаны с телом клетки при помощи дисков. Наружный диск находится в клеточной стенке, внутренний в ЦПМ. В состав жгутиков входит белок флагеллин, он относится к числу сократительных белков, обладает высокой антигенной активностью и специфичностью (см. Н-антиген).

Для изучения жгутиков существуют прямые и косвенные методы. Прямые – это электронная микроскопия и световая после окраски по Лёффлеру. Косвенные – посев уколом в столбик полужидкого агара и микроскопия нативного материала в препаратах «висячая» и «раздавленная» капли в световом и фазово-контрастном микроскопах.

По наличию жгутиков и их расположению микробы разделяются на монотрихи – имеют 1 жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков с одной стороны, амфитрихи – по одному жгутику или по пучку жгутиков по полюсам, перитрихи – жгутики по всей поверхности тела клетки, атрихи – без жгутиков.

Помимо жгутиков есть ворсинки (пили, бахромки) – это органы прикрепления. Наиболее изучены 2 вида пилей – половые (sex) пили, через которые идет передача генетического материала из клетки донора в клетку реципиента в процессе конъюгации, и пили, обеспечивающие прикрепление или адгезию бактерий к определенным клеткам организма хозяина.

 

 

НУКЛЕОИД, ФУНКЦИЯ,МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОИДА.

Нуклеоид (хромосома). Нуклеоид бактерий содержит циркулярно-замкнутую двойную нить ДНК, располагается в цитоплазме в виде клубка. У нуклеоида нет ядерной оболочки, ядрышек, белков гистонов и протаминов; при этом микробная клетка не делится митозом, т.к. нет митотического аппарата.

В нуклеоиде есть ДНК, РНК и ферменты, в частности РНК-полимераза. РНК и РНК-полимераза находятся в центре, а на них намотана ДНК, которая расположена компактно. Один конец ДНК связан с мезосомами ЦПМ, что способствует разделению дочерних хромосом при репликации. Бактерии – гаплоидные существа. Содержат 1 молекулу ДНК, ее можно рассматривать как одиночную хромосому, в расправленном состоянии ее длина 1 мм.

Форма нуклеоида различна: сферическая, палочковидная, подковообразная. В клетке в зависимости от физиологического состояния может быть один или кратное двум количество нуклеоидов. В молодых клетках – несколько, в старых – 1, у кокков – 1, у палочковидных – много.

Функции нуклеоида: хранитель генетической информации, которая закодирована в ДНК; принимает участие в генетических процессах (мутациях, рекомбинациях), а также в делении бактерий и спорообразовании.

Доказательства наличия нуклеоида:

– цитохимическая реакция Фельгена на ДНК. На мазок бактерий наносят соляную кислоту, при этом из дезоксирибозы образуются альдегиды, которые с фуксинсернистой кислотой реактива Шиффа дают фиолетовое окрашивание;

– люминесцентная микроскопия: при окраске мазка акридиновым оранжевым ДНК в ультрафиолете светится зеленым светом, РНК – красным;

– электронная микроскопия ультратонких срезов.

 

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ

I. Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную карболово-спиртовым раствором генцианового фиолетового и сверху капают несколько капель дистиллированной воды на 1-2 мин.

2. Убирают фильтровальную бумагу и, не промывая водой, наносят раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Сливают раствор Люголя и обесцвечивают спиртом – 30 секунд.

4. Тщательно промывают водой.

5. Докрашивают водным раствором фуксина 1-2 мин., промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: Гр(+) бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, Гр(-) бактерии – в розовый.

II. Окраска по Бурри-Гинсу:

1. Каплю взвеси микробов смешивают с каплей туши на обезжиренном стекле и готовят мазок шлифованным краем стекла, как мазки крови, высушивают, фиксируют.

2. Наносят водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: на темном фоне туши видны неокрашенные светлые капсула, внутри которой – красные бактерии.

III. Окраска по Ожешко :

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 мин.

2. Кислоту сливают, промывают мазок, просушивают, фиксируют в пламени горелки.

3. Через фильтровальную бумагу наносят карболовый фуксин Циля, подогревают над пламенем горелки до трехкратного появления паров.

4. Снимают бумагу, промывают водой.

5. Обесцвечивают мазок 5% раствором серной кислоты 1-2 мин.

6. Промывают водой.

7. Докрашивают метиленовым синим 3-5 мин.

8. Промывают,высушивают, микроскопируют.

Результат: споры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий.

 

 

IV. Окраска по Нейссеру:

1. На фиксированный мазок наносят ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.

2. Наносят раствор Люголя на 10-30 секунд.

3. Промывают водой.

4. Докрашивают раствором везувина или хризоидина 0,5-1 мин.

5. Промывают, высушивают, микроскопируют.

Результат: зерна волютина окрашиваются в темно-синий цвет, цитоплазма бактерий – в желто-коричневый.