Прямое противовирусное действие фоспренила

Под прямым противовирусным действием фоспренила мы понимаем непосредственное нарушение препаратом одной или нескольких основных фаз жизненного цикла вирусов: неспецифическое связывание фоспренила с вирионами вне клетки, препятствие сорбции вируса на клетках (блокирование клеточных рецепторов на мембране), нарушение репликации и сборки вирусных частиц внутри клетки, препятствие выходу вирионов из клетки.

В экспериментальных исследований in vitro нам удалось выявить способность фоспренила подавлять размножение целого ряда ДНК- и РНК-содержащих вирусов, играющих важную роль в патогенезе животных и человека. Подробнее об этих экспериментах можно ознакомиться и в других публикациях данныго автора и соавторов.

В таблице 26 представлены данные о противовирусном действии ФП in vitro в отношении вирусов, играющих важную роль в инфекционной патологии домашних и сельскохозяйственных животных.

Таблица 26. Противовирусная активность фоспренила

Вирус	Нуклеиновая кислота	Наличие оболочки	Разница в титрах вирусов в контроле (без ФП) и опыте (в присутствии ФП), lg ЦПД50
чумы плотоядных	РНК	+	2,25
болезни Ауески	ДНК	+
диареи крупного рогатого скота	РНК	+	1,5
инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота	ДНК	+	2,25
аденовирус 1-го типа	ДНК	-	0*
парвовирус	ДНК	-	0*

* - регистрировалось даже некоторое незначительное усиление размножения вируса в присутствии фоспренила

 

Прежде всего отметим, что сам факт противовирусного действия ФП in vitro в отношении ДНК- и РНК-содержащих вирусов свидетельствует о наличии у фоспренила способности нарушать одну или несколько фаз жизненного цикла этих вирусов. Возникает вопрос: на каком этапе (или этапах) взаимодействия вирус-клетка проявляется антивирусное действие препарата? Необходимо отметить, что выявление этих этапов представляет достаточно сложную проблему.

Как видно из данных, приведенных в таблице, разница между титрами вирусов в контроле и опыте колеблется от сравнительно небольшой (10-кратное подавление размножения вируса болезни Ауески в чувствительной культуре клеток) до весьма значительной (фоспренил снижает титры вирусов чумы плотоядных и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота более чем в 100 раз). Заметим, что у вирусологов в таких опытах значительной считается разница от 1,5 lg (30-кратное подавление размножения вируса) и более.

В ходе экспериментов мы выявили следующую закономерность: если в культуру клеток сначала вносить необходимое количество ФП (как правило, 200 мкг/мл), затем оставлять клетки контактировать с препаратом в течение разных промежутков времени (1 час, 2 часа, 24 часа или 48 часов), а затем заражать вирусом, то никакой разницы в титрах вируса между контролем и опытом не выявляется. Логично предположить, что препарат не действует на этапе сорбции вируса на клетки и не блокирует специфические для вируса клеточные рецепторы. Противовирусный эффект препарата проявлялся лишь в тех случаях, когда вирус и ФП вносили в культуру одновременно (или предварительно в течение непродолжительного времени 0,5 часа инкубировали вирус с препаратом). Исходя из полученных результатов, нами была выдвинута гипотеза о том, что фоспренил взаимодействует с вирионами вне клетки. Для проверки этой гипотезы мы провели серию экспериментов, используя реакцию прямой гемагглютинации. Эта методика была выбрана нами, исходя из ряда соображений

Было обнаружено, что фоспренил обладает выраженной дозозависимой гемагглютинирующей активностью в отношении эритроцитов гуся (ЭГ) и не обладает таковой в отношении эритроцитов собаки или кошки. Хорошо известно, что вирус клещевого энцефалита агглютинирует ЭГ, поэтому реакция торможения гемагглютинации в присутствии противовирусных антител давно используется для определения титров антител к вирусу. В многократно повторенных экспериментах мы показали, что фоспренил блокирует гемагглютинирующую активность вируса (так и наоборот: вирус тормозит гемагглютинацию ЭГ фоспренилом). Полученные данные, на наш взгляд, подтвердили гипотезу о том, что фоспренил может взаимодействовать с вирионами вне клетки, по-видимому, образуя устойчивые комплексы фоспренил-вирус, и тем самым препятствовать заражению чувствительных клеток. Однако этот механизм прямого противовирусного действия фоспренил - не единственный.

Выявилась также и другая закономерность.

Во всех опытах (вне зависимости от того, какой вирус был объектом исследований, и какая культура клеток использовалась для размножения вирусов) проявление цитопатического действия вируса в культуре в присутствии фоспренила всегда регистрировалось на 24-48 часов позднее, чем в контрольных зараженных клетках даже при высоких дозах вируса. Нас заинтересовал вопрос: не изменяет ли препарат вирулентность урожая вируса? Для ответа на этот вопрос мы протитровали урожай вне- и внутриклеточного вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (относится к герпесвирусам): а) контрольный, то есть полученный без внесения фоспренила и б) экспериментальный, полученный на культуре, которую заражали вирусом в присутствии фоспренила на свежей культуре клеток. Оказалось, что титр урожая вируса во всех контрольных пробах значительно выше, чем в таковых, которые заражали вирусом в присутствии препарата. Причем эта разница отчетливо выявлялась как в пробах, исходно зараженных высокими дозами вируса, где первичное проявление ЦПД визуально в световом инвертированном микроскопе выглядело одинаково в контроле и опыте, так и в пробах, инфицированных более низкими дозами. Суммарно титры урожая вируса, полученного в клетках на фоне действия препарата, были на 3-4 lg меньше, чем урожай контрольного вируса. Этот факт свидетельствует о другом механизме прямого противовирусного эффекта препарата. Одним из объяснений этого факта может служить предположение, что на фоне действия фоспренила внутри клетки часть вирионов формируются дефектными (не способными заражать другие клетки). Частичным подтверждением этого предположения могут быть предварительные данные исследования урожая вируса клещевого энцефалита, полученные методом электронной микроскопии. Так, было установлено, что среди вирусных частиц в урожае (после действия фоспренила) встречается множество вирионов с разрыхленной оболочкой и без оболочки. Почему же вирионы под воздействием фоспренила формируются дефектными? Точного ответа на этот вопрос пока нет. Однако существуют несколько гипотез, которые в данный момент находятся в стадии экспериментальной проверки.

Другим объяснением существенного снижения вирулентности урожая вируса при воздействии фоспренила является возможная (опосредованная вирусами) стимуляция препаратом интерферона (или других внутриклеточных вирусных ингибиторов). Здесь уместно напомнить данные, приведенные выше: при одновременном введении в организм животного вируса и фоспренила наблюдается значительная стимуляция ИФН. При этом реализация такого механизма противовирусного действия ФП зависит с одной стороны от культуры клеток, а с другой – от структуры и особенностей внутриклеточного цикла размножения вируса. Экспериментальное подтверждение существования такого механизма антивирусного действия ФП смогло бы объяснить некоторые на первый взгляд противоречия, полученные в опытах in vitro (см. таблицу 26):

Почему фоспренил в такой разной степени снижает размножение "близкородственных" (принадлежащих к одному и тому же семейству Herрesviridae) вирусов – вируса болезни Ауески в 10 раз, а вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота – более чем в 100 раз? В первом случае титрование вируса проводилось на первичной культуре куриных фибробластов, во втором – на перевиваемой культуре клеток почек теленка (Таурус 1). Если предположить, что фоспренил, внесенный в культуру вместе с вирусом, способен каким-то образом трансформировать клеточный метаболизм и стимулировать синтез интерферона, то разница в степени противовирусной активности ФП в отношении этих вирусов объяснялась бы различной способностью этих культур продуцировать интерферон. Аналогичным образом можно было бы объяснить существенные различия противовирусного действия препарата в отношении других вирусов, полученных на разных культурах клеток: каждая культура клеток в различной степени способна под влиянием препарата синтезировать интерферон. Здесь необходимо отметить следующий интересный факт: визуально культуры клеток после внесения фоспренила выглядят несколько иначе, чем контрольные, необработанные препаратом.

Еще одна особенность противовирусной активности препарата на этапах взаимодействия вирус-клетка отчетливо прослеживается в данных, приведенных в таблице 26: прямое противовирусное действие ФП проявляется только в отношении вирусов, содержащих внешнюю оболочку. Так, нами не было выявлено никакой противовирусной активности ФП в отношении аденовируса крупного рогатого скота (штамм В-10).Однако имеются данные, что фоспренил способен подавлять размножение аденовируса собак 2-го типа in vitro.

Чем можно объяснить различия в полученных данных? С одной стороны результаты были получены на разных культурах клеток, а это обстоятельство может иметь значение, если подтвердится гипотеза о способности ФП стимулировать интерферон в определенных культурах клеток. С другой стороны, в опытах с аденовирусом крупного рогатого скота мы определяли способность фоспренила предотвращать размножение вируса по проявлению ЦПД в культуре. В экспериментах с аденовирусом собак различия были выявлены по способности вируса образовывать в культуре бляшки, а данный метод включает нанесение на культуру агарового покрытия. Не исключено, что агаровое покрытие увеличило контакт фоспренила с культурой и тем самым усилило его действие. Подобное объяснение косвенно подтверждается данными, полученными в опытах in vivo: оказалось, что если ФП вводить вместе с желатином (примерным аналогом агара), противовирусное действие препарата значительно увеличивается.

Данные, приведенные в настоящем разделе, свидетельствуют о способности препарата комплексно действовать против вирусной инфекции, как на уровне целого организма (иммуномодуляция), так и на уровне взаимодействия вирусов с клетками-мишенями: связываться с вирусами вне клеток, препятствуя сорбции последних на клеточных рецепторах, стимулировать синтез интерферона внутри клеток, не исключено, что фоспренил нарушает сборку вирионов на уровне гликозилирования вирусных белков внутри клетки (прямое противовирусное действие). При этом, в зависимости от конкретной вирусной инфекции, в организме животных фоспренил может осуществлять защитное действие как оптимальный иммуномодулятор - в случаях инфекций, вызываемых безоболочечными вирусами, а в случаях инфицирования организма вирусами, содержащими внешнюю оболочку – двояко: и как иммуномодулятор, и как препарат прямого противовирусного действия. Какой из этих двух механизмов противовирусного действия ФП оказывается решающим – предстоит выяснить в ходе дальнейших экспериментальных и клинических исследований.