Щодо проведення лабораторно-практичних

МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Щодо проведення лабораторно-практичних

Занять зі спеціальної мікробіології

Дніпропетровськ, 2010

Методичні рекомендації до розділу спеціальної ветеринарної мікробіології дисципліни „Ветеринарна мікробіологія”. Дніпропетровський державний аграрний університет Дніпропетровськ, 2010. – 58 с.

Методичні рекомендації складені відповідно до програми із спеціальної мікробіології. Кількість, перелік та порядок виконання робіт на лабораторних заняттях визначені робочим планом вивчення курсу мікробіології. Кожна робота розпочинається коротким теоретичним обґрунтуванням матеріалу для вивчення що полегшує самостійну підготовку студентів до виконання лабораторних завдань.

Методичні рекомендації розраховані для проведення лабораторних занять, призначених для студентів 2 курсу з повним та скороченим терміном навчання факультету ветеринарної медицини.

 

Укладачі: Ткаченко О.А. – д.в.н., професор

Усеєва Н.Г. – ст. викладач

Білан М.В. – к.в.н., доцент

 

Рецензенти: професор кафедри паразитології та інвазійних хвороб М.П. Високос.

 

Методичні вказівки розглянуто і ухвалено до друку кафедрою епізоотології та інфекційних хвороб 22.12.2004 року, протокол № 7 та науково-методичною радою факультету ветеринарної медицини ДДАУ 25.12.2004 р., протокол № 4.

 

Тема 1. Лабораторна діагностика стафілококозів

Стафілококози – бактеріальні інфекції, які викликаються патогенними стафілококами, супроводжуються характерним утворенням у різних місцях тіла тварин гнійників, розвитком гноєрідних процесів у вигляді абсцесів, флегмон, маститів, ендометритів, пневмоній, артритів, сепсису. Токсигенні штами стафілококів можуть викликати харчові отруєння у людей. До хвороби схильні коні, велика рогата худоба, вівці, кози, свині, рідко птиця.

Названі бактерії відносять до роду Staphylococcus. По сучасній класифікації (1984) їх більше 20 видів. Практичний інтерес мають патогенні (гемолітичні) коки в основному вид S. aureus, рідко S.epidermidis.

Патологічним матеріалом при стафілококозах є гнійний ексудат з ран, при маститах – проби молока з ураженого вим’я, гній з абсцесів, при ендометритах виділення з матки. Матеріал відбирають стерильними ватними тампонами або стерильними шприцами і поміщають у стерильні пробірки, закривають пробками, доставляють у лабораторію.

Бактеріологічне дослідження включає: виявлення збудника у матеріалі методом світлової мікроскопії, виділення чистої культури посівом на живильні середовища і ідентифікацію збудника за морфологічними, культуральними, ферментативним та токсигенними ознакам (методом біопроби).

Мікроскопія: на предметне скло наносять краплю фізіологічного розчину і вносять (розтирають) бактеріологічною петлею краплю гною. Мазки висушують, фіксують, фарбують за Грамом. Стафілококи мають кулясту форму діаметром 0,8-1,0 мкм (сапрофіти крупніші – 2-4 мкм), розміщуються різними за величиною скупченнями типу виноградного грона. В мазках із патологічного матеріалу зустрічаються моно- і диплококи, грампозитивні, не рухливі, не утворюють спор та капсул.

Культивування та культуральні властивості. Виділення культур стафілококів здійснюють за допомогою простих середовищ (МПБ та МПА), на які пастерівською піпеткою висівають гній, ексудат. Оптимальна температура росту 35–37⁰С, але можуть рости в межах 10–45⁰С. Аероби та факультативні анаероби. На МПБ через 24–48 год стафілококи обумовлюють інтенсивне помутніння та утворення значної кількості осаду. Можливе утворення сірувато-білого пристіночного кільця або плівки. На МПА через 12–24 год росту утворюють круглі, випуклі, соковиті, непрозорі колонії діаметром 2–4 мм. Колір їх залежить від виду стафілококу і пігменту, що ним виробляється: золотистий, кремовий, лимонно-жовтий, білувато-сірий. При дослідженні патологічного матеріалу для посіву необхідно користуватись селективним середовищем – сольовим кров’яним МПА (МПА з 8–10% NaCl і 5% дефібринованої крові). Застосування цього середовища основане на здатності стафілокока витримувати високі концентрації солі (до 16%). Інші види мікробів в таких умовах не ростуть. Патогенні стафілококи на кров’яному МПА навколо колоній утворюють прозору зону гемолізу.

Певне діагностичне значення має здатність стафілококів рости на МПА з кристалічним фіолетовим, на якому патогенні види утворюють колонії фіолетового або оранжевого кольору, ріст непатогенних стафілококів пригнічується.

Ферментативна (біохімічна) активність – їх визначення має особливе діагностичне значення. Окремі біохімічні властивості враховують як фактори патогенності. Стафілококи володіють протеолітичними властивостями: розріджують стовбчиком желатину (МПЖ), розріджують звернуту кров’яну сироватку, звертають молоко і пептонізують згусток казеїну, що утворився. Важливе діагностичне значення має визначення реакції плазмокоагуляції та ДНК-азної активності.

Реакцію плазмокоагуляції ставлять у пробірках, що містять цитратну сироватку крові кролів. Досліджувану культуру висівають і інкубують при 37⁰С. Патогенні стафілококи через 2–10 год коагулюють плазму. Якщо пробірки залишити довше у термостаті, то під дією фібринолітичного ферменту згусток плавиться.

ДНК-азну активність визначають на МПА з розчином натрієвої солі ДНК в чашках Петрі. Після 18–20 год культивування у чашку додають соляну кислоту і через 2–3 хв зливають. Навколо колоній патогенних видів утворюється прозора зона, що свідчить про продукування ДНК-ази.

Стафілококи мають також цукролітичні властивості: ферментують (розщепляють) до кислоти лактозу, глюкозу, сахарозу, гліцерин, маніт. Ферментація маніту властива патогенним видам.

Для виявлення патогенності стафілококів застосовують біологічну пробу на кролях та кошенятах. Для виявлення дермонекротоксину бульйонну культуру стафілококу вводять у товщу шкіри кролю в дозі 0,2 мл. В позитивних випадках через 24–48 годин спостерігається некроз шкіри.

Наявність летального токсину можна доказати шляхом внутрішньовенного введення фільтрату бульйонної культури стафілокока кролям в дозі 0,75 мл на 1 кг маси тіла. Під дією названого токсину тварини гинуть через 15 хв.

В окремих випадках (при отруєннях) для виявлення ентеротоксину кошенятам перорально (з молоком) вводять фільтрат вбитої культури. При наявності ентеротоксину через 1–2 год у тварин виникають симптоми гастроентериту та блювання.

Таким чином, заключний бактеріологічний діагноз оснований на врахуванні описаних характерних морфологічних, тинкторіальних, культурально-біохімічних та патогенних властивостей виділеної з патологічного матеріалу культури стафілококів.

Для патогенних стафілококів характерні: гемоліз, ферментація маніту, ДНК-азна активність, ріст у середовищі з додаванням кристалвіолету, реакція плазмокоагуляції, некротизуюча здатність, наявність летального токсину.

 

Тема 6. Патогенні анаероби

Патогенні анаероби – це збудники багатьох захворювань: злоякісного набряку, дизентерії ягнят, брадзоту, ентеротоксемії овець, емфізематозного карбункула, правця, ботулізму, некробактеріозу. Усі вони, за винятком останнього, належать до роду Clostridium, представники якого – паличкоподібні (частіше рухливі), утворюючі спори, діаметр яких перевищує товщину вегетативної клітини. У молодих культурах – грампозитивні, у старих – грамнегативні. Більшість штамів облігатні (суворі) анаероби.

 

Біохімічні властивості.

Сl. perfringens – інтенсивно проявляються цукролітичні властивості, а саме, ферментує з утворенням кислоти та газу лактозу, сахарозу, мальтозу. Типовим для цього мікроба є характер звертання молока – утворюється губчатий згусток казеїну, який завдяки пухирцям газу піднімається нагору.

Сl. septicum – інтенсивно виражені цукролітичні властивості – ферментує глюкозу, лактозу з утворенням кислоти та газу. Протеолітичні властивості виражені слабо.

Сl. novyi володіє цукролітичними властивостями не однаково, в залежності від сероваріантів, але усі ферментують гліцерин. Протеолітична активність збудника також незначна.

Сl. histolyticum – цукри не ферментує. Збудник має виражені протеолітичні властивості: розріджує желатину, коагулює сироватку крові, пептонізує молоко.

Біопроба. Суспензію патологчного матеріалу морським свин-кам вводять підшкірно або внутрішньом’язево. При наявності збудників злоякісного набряку тварини гинуть протягом 16–48 год. На місці ін’єкції у них – кров’яний набряк, крапкові крововиливи. Підшкірна клітковина набрякла й геморагічно інфільтрована, м’язи темно-червоного кольору, присутні ознаки газоутворення. Трупи розтинають, роблять мазки-відбитки з місця ін’єкції та поверхні печінки. Інколи біопробу ставлять з метою оцінки вірулентності збудника. Добову бульйонну культуру морським свинкам вводять підшкірно чи внутрішньом’язево в дозі 0,5–1 мл. Свинки гинуть з вищеназваними ознаками.

Серологічна ідентифікація збудників. З метою ідентифікації збудників використовують реакцію нейтралізації (за Ерліхом) зі специфічною антитоксичною сироваткою. Мінімальну, смертельну для морських свинок дозу культури або її фільтрату змішують з 0,2–0,5мл відповідної типоспецифічної сироватки й витримують у термостаті протягом 45 хв. Після чого вводять гризунам підшкірно або внутрішньочеревно. Для контролю одночасно вводять культуру або фільтрат, не оброблені специфічною сироваткою. Вид збудника визначають за сироваткою, яка “захищає” морських свинок від загибелі, тобто нейтралізує його токсини. Усі інші та контрольні тварини гинуть.

Збудники брадзоту – Cl. septicum, Cl. novyi

– викликають гостре, неконтагіозне захворювання овець і кіз, що характеризується геморагічним запаленням сичуга й дванадцятипалої кишки, судомами, високою летальністю. Для бактеріологічної діагностики у лабораторію надсилають сичуг та дванадцятипалу кишку з вмістом, ексудат з грудної та черевної порожнини, некротичні ділянки печінки. Матеріал повинен бути абсолютно свіжим, відібраним зразу ж після загибелі тварини. Порядок дослідження такий, як і при діагностиці злоякісного набряку.

Збудник анаеробної ентеротоксемії овець – Cl. perfringens типів D і C. Викликає брадзотоподібне неконтагіозне захворювання овець усіх вікових груп, що характеризується геморагічним ентеритом, нервовими явищами, ураженням нирок, загальною інтоксикацією. У практиці нерідко захворювання називають “розм’якшена нирка”. У лабораторію надсилають уражені нирки та відрізки уражених кишок з вмістом, ексудат з черевної порожнини. Порядок дослідження такий же.

Збудник анаеробної дизентерії ягнят – Cl. perfringens типу В викликає гостру токсикоінфекцію новонароджених ягнят, яка характеризується геморагічним запаленням кишечника, діареєю. У лабораторію надсилають труп або кишечник з вмістом. Мазки фарбують за Грамом, висівають на середовище Кітта-Тароцці (роблять пересів два-три рази для виділення чистої культури анаеробів). З вмісту кишечника безпосередньо виділяють токсин. Для цього вміст змішують з подвійною кількістю ізотонічного розчину, екстрагують, фільтрують або осаджують на центифузі. Специфічність отриманого токсину визначають за допомогою типоспецифічних сироваток в реакції нейтралізації за Ерліхом.

 

Некробактеріозу

 

Збудник правця (стовбняка) – Cl. tetani викликає гостре інфекційне неконтагіозне захворювання тварин та людини, що характеризується підвищеною рефлекторною збудливістю, клонічними і тонічними скороченнями мускулатури тіла або окремих груп м’язів, високою смертністю, зумовлене продукцією надзвичайно сильного екзотоксину. Захворювання розвивається в результаті попадання збудника у рани. Хвороба може виникнути після родових травм, кастрації, обрізання хвостів або пуповини у новонароджених, якщо при цих операціях були порушені правила асептики та антисептики.

Патологічний матеріал направляють при сумнівних випадках. У лабораторію надсилають відібраний запальний ексудат з рани, шматочки тканин, взяті з глибини ураженої ділянки.

Мікроскопія. У мазках фарбованих за Грамом виявляють тоненькі (4–8 мкм), розміщені поодиноко, грампозитивні, рухомі палички, частина яких утворила спору. Спора, як правило, розміщується термінально, діаметр спори перевищує діаметр вегетативної клітини, надаючи форму барабанної палички. Капсул збудник не утворює.

Культуральні властивості. З метою знищення посторонньої мікрофлори перед посівом матеріал прогрівають протягом години при 80⁰С. Посів здійснюють пастерівською піпеткою в середовище Кітта-Тароцці. При наявності збудника середовище мутніє, а через 72 годин стає прозорим, відмічають слабке газоутворення, характерний запах. З рідкого середовища роблять пересів на глюкозокров’яний агар, на якому збудник утворює ніжні колонії з випуклим центром і нерівними краями, інколи – маленькі круглі колонії.

Біохімічні властивості виражені слабо і не мають діагностичного значення.

Біопроба має основне діагностичне значення. Ставлять її на білих мишах або морських свинках. Тварин заражають з метою вияву екзотоксину у патологічному матеріалі, а також у виділеній культурі. Для вияву екзотоксину у патологічному матеріалі, останній розтирають у ступці, заливають подвійною кількістю фізіологічного розчину й залишають на годину. Фільтрують через ватно-марлевий чи паперовий фільтр. Фільтрат вводять підшкірно двом-трьом білим мишам або морським свинкам. При наявності токсину Cl. tetani через два-три дні у тварин спостерігають характерні ознаки. Вони гинуть у характерній позі з витягнутими кінцівками.

З метою вияву токсину одержану культуру фільтрують, центрифугують для відокремлення бактерій. Надосадову рідину вводять у дозі 0,3–0,5 мл білим мишам чи морським свинкам підшкірно. При наявності токсину тварини гинуть через 2–5 діб з характерними клінічними ознаками.

Ідентифікація токсину. Змішують в однаковій кількості фільтрат з протиправцевою сироваткою й витримують у термостаті 40 хв. Вводять лабораторним тваринам. Якщо вони не загинули, значить у фільтраті є токсин.

 

Збудник ботулізму

 

Ботулізм – кормове (харчове) отруєння, кормова токсикоінфекція, зумовлена токсином Cl. botulinum. Захворювання характеризується ураженням центральної нервової системи, розвитком парезів, паралічів, летальністю 80–100%.

Патологічний матеріал. Бактеріологічна діагностика ботулізму полягає у виявленні ботулінічних токсинів, а також самого збудника. У лабораторію надсилають проби корму (силос, зерно, дерть, м’ясні і рибні відходи тощо), вміст шлунку, відрізки кишок з вмістом.

Проби корму і вміст шлунка ретельно розтирають у ступці з стерильним піском чи склом, заливають подвійною кількістю фізрозчину й використовують для вияву токсину і виділення збудника.

Вияв ботулінічного токсину. Підготовлену пробу витримують 1–2 год при кімнатній температурі, фільтрують через фільтр Зейтця (ватно-марлевий фільтр або осадити на центифузі) і поділяють на три частини. Одну частину вводять лабораторним тваринам підшкірно – при наявності токсину тварини гинуть; другу прогрівають при 80⁰С 30 хв і вводять морським свинкам – токсин термолабільний, при прогріванні розрушується, морські свинки повинні залишитись живими; третю використовують для встановлення специфічності токсину: її змішують з полівалентною антитоксичною сироваткою антиботулінус, витримують у термостаті 1–2 год, потім суміш вводять підшкірно морським свинкам – якщо у фільтраті міститься токсин, він нейтралізується специфічною сироваткою (антитоксинами), тварини залишаються живими. Такий результат дає підставу для заключного діагнозу – ботулізм.

Мікроскопія. Збудник – крупна (4–6 мкм), рухома, грампозитивна паличка, розміщується поодиноко або скупченнями. Утворює стійку спору (витримує кип’ятіння 5–6 год), яка розміщується термінально (рідко субтермінально) овальної форми, що нагадує тенісну ракетку. Капсул не утворює.

Культуральні властивості. Посів роблять на середовище Кітта-Тароцці або кров’яний агар. Культивують в анаеробних умовах. У рідкому середовищі збудник зумовлює помутніння, потім – утворення осаду й прояснення рідини, газоутворення. На агарі утворюються колонії неправильної форми з відростками, навколо яких – зона гемолізу.

 

Збудник некробактеріозу

Збудник некробактеріозу (фузобактеріозу) – Fusobacterium necrophorum викликає інфекційне захворювання з ознаками гнійно-некротичного розкладу тканин у більшості кінцівок. Інколи процес генералізується. При цьому утворюються метастази – некротичні вогнища у печінці, легенях, нирках тощо.

Патологічним матеріалом являється уражена тканина, відібрана на межі з неураженою. Некротизовану тканину розтирають у ступці з невеликою кількістю фізрозчину і використовують для виділення чистої культури.

Мікроскопія. Мазки фарбують за Грамом. Збудник у мазках з патматеріалу має вигляд ниткоподібних ланцюжків, фарбується нерівномірно. У мазках з культури – тонка, нерухома, грамнегативна паличка, спор і капсул не утворює.

Культуральні властивості. Збудник є анаеробом, тому посів матеріалу здійснюють на середовище Кітта-Тароцці. Інкубують протягом двох-трьох діб при 37⁰С. Збудник зумовлює помутніння середовища.

Біопроба. Чисту культуру із забрудненого постороньою мікрофлорою патматеріалу отримати важко, тому поступають так: суспензією некротизованої тканини заражають кроля. Після його загибелі труп розтинають, із осередків уражених внутрішніх органів проводять посіви на живильні середовища, готують мазки-відбитки з ураженого осередка. Для біопроби використовують також білих мишей, вводячи культуру чи суспензію патматеріалу підшкірно. Гризуни гинуть на 6–10 день.

 

Тема 8. Збудник ешеріхіозу

 

Ешеріхіоз (колібактеріоз, коліентеротоксемія) – гостре інфекційне захворювання новонароджених тварин, різних видів (включаючи птахів і хутрових звірів). Характеризується профузним проносом, зневодненням організму, депресією, слабкістю, явищами септицемії й токсемії. Хвороба перебігає у трьох клінічних формах: септичній, ентеротоксемічній та ентеритній. Прояв тієї чи іншої фо-рми залежить від токсинів, продукованих збудником. Телята сприй-нятливі у перші години і дні після народження; поросята хворіють як у період новонародженості, так і після відйому. Крім того, у поросят зустрічається ще одна форма ешеріхіозу – набрякова хвороба. Птахи уражуються в основному у перші 2–4 міс. Дорослі тварини колібакте-ріозом не хворіють, але являються бактеріоносіями патогенних шта-мів збудника.

Патологічний матеріал. У лабораторію надсилають свіжий труп або відбирають від нього трубчасті кістки, селезінку, шматок печінки з жовчним міхуром, лімфатичні вузли брижі, головний мозок. Окремо надсилають перев’язану з двох кінців ділянку ураженого тонкого кишечнику. При діагностиці колібактеріозу птиці одночасно із свіжими трупами відправляють п’ять-шість живих хворих особин, яких забивають у лабораторії й відбирають необхідний матеріал.

Мікроскопія. Із патологічного матеріалу готують звичайні мазки і кляч-препарати, які фарбують за Грамом. Е. соlі – коротка (2–3 мкм), товста, грамнегативна поліморфна паличка із заокругленими кінцями, розміщується поодиноко, рухлива (перитрих), не утворює спор. Окремі серотипи з підвищеною вірулентністю можуть утворю-вати капсулу.

Культуральні властивості. Із патологічного матеріалу пастерівською піпеткою здійснюють посів на МПА і МПБ у пробірках, а також на диференційні середовища Ендо і Левіна у бактеріологічних чашках. Для цього притримуючи стерильним пінцетом, стерильними ножицями вирізають шматочок органів і розрізаною поверхнею доторкуються поверхні середовища. Засіяні пробірки і чашки витримують у термостаті протягом 18–24 год при 37⁰С. В МПБ ешеріхії зумовлюють інтенсивне рівномірне помутніння середовища. На МПА утворюються колонії S-форми, округлі з рівними краями, гладкою, блискучою поверхнею, сіруватого кольору.

При підозрі на набрякову хворобу поросят матеріал висівають на МПА з кров’ю. У позитивному випадку навколо колоній утворюється зона бета-гемолізу.

Біохімічні властивості у ешеріхій досить виражені. З метою їх вивчення, виділену з органів молоду культуру, висівають на барвистий ряд. Останній включає диференційно-діагностичні середо-вища Гіса з лактозою, манітом, цитратно-амонійне середовище Сімонса, Ендо, Левіна, МПЖ. Мікроб ферментує до кислоти і газу глюкозу, лактозу, маніт, мальтозу. Продукує індол, не виділяє сірководень. Коагулює молоко без пептонізації згустку. Не розщеплює сечовину та нітрати, у зв’язку з чим не росте на середовищі Сімонса, не розріджує желатину.

На середовищі Ендо, до складу якого входять звичайний МПА, лактоза та індикатор (фуксин, знебарвлений сульфітом натрію), колонії набувають темно-малинового кольору з металевим блиском. Причиною забарвлення колоній є здатність ешеріхій ферментувати лактозу (на відміну від сальмонел, які інертні до цього вуглеводу), при цьому утворюється молочна кислота, під дією якої відновлюється колір фуксину, який надає колоніям відповідний колір. На середовищі Левіна кишкова паличка утворює колонії фіолетового або чорного кольору. Існують і лактозонегативні штами ешеріхій.

Біопроба проводиться з метою визначення патогенності виді-лених культур. Використовують дві культури виділені з внутрішніх органів і вирощені на МПА. Культуру змивають фізіологічним роз-чином і вводять у черевну порожнину трьом білим мишам. Якщо протягом двох діб після зараження загине хоча б одна миша, культуру вважають патогенною.

Біопробу на курчатах ставлять у випадку виділення збудника у птиці. Трьом курчатам 4–5-тижневого віку у черевну порожнину вводять змив добової агарової культури. Культуру відносять до патогенної, якщо протягом перших чотирьох днів після зараження загине хоча б одне курча.

Серологічна типізація ешеріхій основана на антигенній будові мікробної клітини. Антигенна структура кишкової палички складна. Виявлено три типи антигенів: О-антиген – соматичний, термоста-більний, міститься у клітинній стінці; Н-антиген – джгутиковий, термолабільний, знаходиться у джгутиках; К-антиген – поверхневий, зв’язаний з капсулою та оболонкою. За останніми даними у кишкової палички виявлено 150 різновидів О-антигенів, 99 – К-антигенів і 50 – Н-антигенів. Відповідно до такої кількості існує адекватна кількість серологічних типів ешеріхій. При позначенні повної антигенної структури конкретного серотипу антигени відділяють двома крапками, вказуючи при цьому їх порядковий номер, наприклад, О141: К85: Н10. Антигеном кожного типу гіперімунізують кролів, отримують специфічні аглютинуючі сироватки. В лабораторіях проводять лише серологічну типізацію кишкової палички по О-антигену.

З цією метою вирощену на МПА культуру змивають фіз-розчином і прогрівають на водяній бані при 100⁰С протягом години або автоклавують для руйнування термолабільних Н і К-антигенів. Прогріті культури ділять на дві частини. Першу використовують, як антиген для РА на склі, другу – як антиген для пробіркової РА.

У краплю полівалентної колі-сироватки бактеріологічною петлею вносять перший антиген і ретельно перемішують до одержання рівномірної суспензії. У позитивних випадках протягом перших трьох хвилин утворюються дрібні крупинки – пластівці аглютинату.

Всі культури, які дали позитивну реакцію аглютинації на склі, досліджують у пробірковій РА з монорецепторними сироватками, які входять до складу полівалентної сироватки.

 

Збудник туляремії

 

Туляремія – гостре інфекційне захворювання тварин, для якого характерні явища септицемії, збільшення лімфатичних вузлів, ураження центральної нервової системи, у корів розвиваються мастити, кобили абортують. Туляремією хворіють також люди. Збудник хвороби – Francisella tularensis, найчастіше уражує поросят, ягнят, кроленят, курчат. Носіями збудника є дикі та домашні гризуни.

Патологічний матеріал. Від хворих тварин відбирають пунктат уражених лімфатичних вузлів, фекалії, сечу, абортовані плоди. Після загибелі тварин відбирають шматочки паренхіматозних органів, збільшені лімфатичні вузли. Трупи гризунів надсилають у лабораторію цілими.

Мікроскопія. Збудник туляремії має форму коковидних паличок, що розміщуються поодиноко. За Грамом фарбується негативно, нерухомий, спор не утворює, має слабку капсулу. Слід зауважити, що мікроскопією можна виявити збудника лише за умови значного обсіменіння ним досліджуваного матеріалу.

Культивування. На простих середовищах збудник не культивується. Для культивування використовують жовткове середовиже Мак-Коя, кров’яний агар Френсиса з цистіном та глюкозою.

Методом прямих посівів збудник можна виділити тільки від гризунів (миші, щурі). При проведенні посіву на тверді середовища з кров’ю з глибин паренхіматозних органів асептично вирізають невеликий шматок тканини, яку прикладають до поверхні живильного середовища. Через 24–48 год після посіву на твердих середовищах з’являються дрібні, білуваті з блакитним відтінком колонії S-типу правильної, округлої форми з гладкою і блискучою поверхнею. На рідких середовищах збудник росте погано.

Біологічна проба є проміжним етапом дослідження тому, що виділення чистої культури із патологічного матеріалу у більшості випадків не можливе. Доказати наявність збудника у первинних матеріалах можна лише за умови постановки спеціальної біопроби. Суспензією патматеріалу заражають морських свинок і білих мишей підшкірно або у черевну порожнину. При достатній кількості збудника в матеріалі тварини гинуть протягом 10 днів. При розтині трупа звертають увагу на характерне запалення та збільшення лімфатичних вузлів, наявність у печінці, селезінці, легенях дрібних сірувато-білих вогнищ некрозу.

У більшості випадків виникає необхідність у проведенні двох-трьох сліпих пасажів збудника туляремії через організм лабораторних тварин.

Усі роботи по виділенню та ідентифікації збудника туляремії можна проводити тільки в лабораторіях із спеціальним режимом для особливо небезпечних інфекцій.

Із серологічних методів діагностики певне значення мають РА (пробірковим методом) та РЗК, які дають можливість виявити специфічні антитіла в сироватці крові досліджуваних тварин.

Для швидкого доказу туляремійного антигена в патологічному матеріалі ставлять реакцію преципітації методом Асколі.

 

Тема 11. Збудник бруцельозу

 

Бруцельоз – хронічне інфекційне захворювання сільськогосподарських тварин багатьох видів та людини. Характеризується абортами, ендометритами, бурситами, артритами, орхітами, епідидимітами. Переважно перебігає безсимптомно.

Збудник віднесений до роду Brucella, який об’єднує шість видів: Brucella melitensis - виділяється переважно від кіз та овець, становить найбільшу небезпеку для людей; Br. abortus - уражує переважно велику рогату худобу; Br. suis - виділяється від свиней; Br. ovis - збудник інфекційного епідидиміту баранів; Br. canis - віділені від собак та Br. neotome від чагарникових пацюків.

Патологічний матеріал. Для бактеріологічного дослідження в лабораторію надсилають дрібні абортовані плоди (від свиноматки – не менше трьох). Від великих плодів відбирають шлунок з вмістом, перев’язаний з двох кінців лігатурами, а також шматочки печінки і селезінки. Крім того, відбирають ділянки плодових оболонок, виділення з родових шляхів, вміст уражених бурс. Одночасно від тварин, що абортували, для серологічного дослідження відбирають проби крові та молока.

Мікроскопія. Мазки (по два з кожного об’єкту) фіксують полу-м’ям, фарбують за Грамом та Козловським.

Фарбування мазків за методом Козловського. Фіксовані мазки фарбують протягом 2 хв 2%-м водним розчином сафраніну з підігріванням до появи парів. Препарат швидко промивають водою, дофарбовують протягом 1 хв 1%-м водним розчином малахітового зеленого, знову промивають водою і висушують.

Бруцели порівняно з іншими бактеріями повільно сприймають анілінові фарби, тому “не встигають” перефарбуватись малахітовим зеленим, зберігають яскраво-червоне забарвлення, тоді як інша мікрофлора й основний фон препарату набувають зеленого кольору.

Бруцели – дрібні, паличко- або кокоподібні бактерії, довжиною до 1,5 мкм; не рухливі, не утворюють спор і капсул, грамнегативні. У мазку розміщуються ізольовано.

Культуральні властивості. Для виділення чистої культури бру-цел використовують спеціальні середовища: м’ясо-пептонний печінковий бульйон (МППБ), печінково-глюкозогліцериновий бульйон та агар, еритрит-агар або сироватково-декстрозний агар та інші. Перед посівом із паренхіматозних органів вирізають шматочки розміром до 2 см, обробляють спиртом і розтирають у ступці з фізіологічним розчином до одержання суспензії, яку сіють пастерівською піпеткою на середовища.

Засіяні бактеріологічні чашки та пробірки поміщають у термо-стат при температурі 37–38⁰С, а посіви від великої рогатої худоби інкубують в атмосфері з вмістом 15% СО₂ в ексікаторі.

За посівами спостерігають протягом 30 днів. Пробірки, чашки, в яких відмічено ріст мікрофлори через 24 год, видаляють.

Бруцели розвиваються досить повільно. Перші ознаки з’являються через 7–10, інколи – через 30-40 днів. При пересівах культури ростуть значно швидше (на 3–5 день).

На поверхні щільних живильних середовищ бруцели утворюють дрібні, блискучі, випуклі, з рівними краями блакитні колонії, які згодом сіріють. В рідких середовищах вони зумовлюють рівномірне помутніння з блакитним пристінковим кільцем. Через кілька днів випадає осад.

Виділені культури ідентифікують за допомогою реакції аглютинації на склі з бруцельозною діагностичною сироваткою. На знежирене предметне скло наносять краплю специфічної бруцельозної сироватки. Бактеріологічною петлею у краплю вносять культуру і ретельно перемішують до утворення рівномірної суспензії. Якщо виділена культура виявиться бруцельозною, то через 1–3 хв утворюються пластівці або грудочки з одночасним проясненням рідини.

Біологічну пробу при діагностиці бруцельозу ставлять на морських свинках. Тварин заражають суспензією із органів і вмісту шлунка на фізрозчині підшкірно з внутрішнього боку стегна.

У заражених свинок інфекція розвивається у латентній формі без будь-яких клінічних ознак. Свинка не гине. У зв’язку з цим у піддослідних тварин беруть проби крові на 15-й, 25-й і 40-й дні після зараження. Одержану сироватку досліджують за допомогою пробіркової РА з бруцельозним антигеном. У випадку вияву специфічних антитіл біопробу вважають позитивною. Морських свинок забивають, відмічають патзміни в селезінці, печінці, лімфатичних вузлах. Проводять бактеріологічне дослідження.

Серологічні методи діагностики бруцельозу основані на виявленні в сироватці крові тварин специфічних антитіл щодо бруцельозного антигену, чого досягають постановкою РА, роз-бенгал проби (РБП), реакції зв’язування комплементу (РЗК), реакції тривалого зв’язування комплементу (РТЗК), РА з молоком.

Роз-бенгал пробу ставлять на емальованій пластинці з лунками. Нерозведену досліджувану сироватку крові мікропіпеткою вносять у лунку і додають бруцельозний антиген, пофарбований бенгальським рожевим. Компоненти перемішують. В позитивному випадку через 4 хвилини з’являються пластівці аглютинату рожевого кольору.

Якщо сироватки дали позитивну РБП, надійшли з благополучного щодо бруцельозу господарства, то їх обов’язково досліджують за допомогою РА і РЗК з метою встановлення титру специфічних антитіл.

 

Збудник сапу

 

Сап – хронічне інфекційне захворювання однокопитних тварин, для якого характерним є утворення у внутрішніх органах, на слизових оболонках (особливо носової перетинки) та на шкірі специфічних вузликів, що розпадаються з утворенням виразок. Хвороба досить небезпечна для людини.

Збудник – Pseudomonas mallei. Діагностика сапу ґрунтується на бактеріологічному, серологічному та алергічному методі дослідження.

Патологічний матеріал. За життя матеріалом для дослідження є виділення з виразок, кров, пунктати з лімфатичних вузлів, гній з абсцесів. Після забою або загибелі від тварин відбирають уражені ділянки внутрішніх органів, носову перетинку, трахею, бронхи.

Мікроскопія. Збудник – дрібна (1–5 мкм), часто зерниста, грам-негативна паличка, яка не утворює спор і капсул, розміщується окремо або парами та коротенькими ланцюжками, нерухома.

Культуральні властивості. Для виділення культури використовують МПА та МПБ з додаванням гліцерину.

На щільному середовищі через 24–48 год утворюються напів-прозорі, гладенькі, середні за величиною колонії з перламутровим блиском, які через деякий час зливаються в загальне ослизле нашарування. В гліцериновому бульйоні виникає помутніння, випадає сірувато-білий слизовий осад.

Найбільш типовий ріст збудника сапу спостерігається на гліцериновій картоплі: через 48–72 год утврюються дрібні, напівпрозорі, з

жовтуватим відтінком колонії, що після злиття формують “медовий” наліт, колір якого змінюється до буро-коричневого.

Біопроба. Заражають підшкірно золотистих хом’ячків або у черевну порожнину самців морських свинок.

При наявності в досліджуваному матеріалі збудника сапу у хо-м’ячків на місці ін’єкції утворюється виразка. Через 5–7 днів вони гинуть. У морських свинок розвивається гнійний орхіт, і через 8–15 днів вони гинуть. З внутрішніх органів виділяють культуру збудника.

Серологічна діагностика ґрунтується на виявленні в сироватці крові хворих тварин специфічних антитіл в РЗК. Її ставлять в період активізації сапного процесу, бо в хронічній стадії вона виявляє не більше 20% хворих тварин.

 

Збудник дизентерії свиней

Дизентерія – інфекційне захворювання свиней, що характеризується явищами гострого катарально-геморагічного коліту, який супроводжується слизово-кровавим проносом. Найбільш характерними клінічними ознаками є діарея й прогресуюче схуднення. Відмічаються спрага, порушення координації рухів. Сприйнятливі свині усіх вікових груп, але частіше хворіє молодняк у віці 1–6 міс.

Збудник захворювання – Treponema hyodysenteriae.

Патологічний матеріал. Для прижиттєвої діагностики в лабораторію від хворих свиней надсилають фекалії, а від забитих або загиблих – слизову оболонку великої ободової кишки. Відібрані матеріали транспортують у лабораторію у термосі з льодом й досліджують протягом 2–4 год, а в умовах холоду – протягом 6–8 год.

Мікроскопія. Лабораторне дослідження на дизентерію зводить-ся переважно до виявлення трепонем у патологічному матеріалі шля-хом його мікроскопії. Із слизової оболонки кишечника і фекалій окремо готують суспензію на фізрозчині, а з неї препарати типу “роздавлена крапля”. Останні досліджують в світловому або темному полі мікроскопа. В позитивних випадках в одному полі знаходиться 5–10 і більше середніх і великих трепонем у вигляді рухливих звивистих ниток з гострими кінцями. Рух змієвидно-поступальний. Мазки з патматеріалу фіксують метиловим спиртом, фарбують за Грамом та фуксином Пфейф