Лабораторна діагностика збудників злоякісного набряку

Злояісний набряк (газова гангрена) – гостре неконтагіозне токсико-інфекційне захворювання, що виникає в наслідок інфікування травмованих тканин або ран і характеризується набряками, змертвінням уражених тканин, інтоксикацією організму та високою летальністю. Хворіють тварини всіх видів і людина. Хвороба виникає після глибоких поранень, інколи після хірургічних втручань та акушерсько-гінекологічних маніпуляцій. Захворювання має полімікробну етіологію. З патматеріалу від хворих тварин найчастіше виділяють Cl. perfringens, Cl. septicum, Cl. novyі (oedematiens), Cl. histolyticum. Кожний з них або в асоціації може викликати захворювання.

Патологічний матеріал. В лабораторію надсилають шматочки ураженої тканини, запальний ексудат. Перед дослідженням матеріал розтирають у ступці, додавши ізотонічний розчин.

Мікроскопія. Мазки фарбують за Грамом. Усі, вище названі збудники, грампозитивні, спороутворюючі, поліморфні палички з заокругленими кінцями, довжиною 2–10 мкм, що розміщуються поодиноко, іноді коротенькими ланцюжками.

Сl. perfringens спору утворює тільки у зовнішньому середовищі та у живильних середовищах при довготривалому культивуванні. Один із усіх даної групи анаеробів в організмі тварин та у середовищах багатих білком – утворює капсули, а також нерухливий.

Сl. septicum спору утворює у трупах та у зовнішньому середовищі. Спора розміщується центрально. Рухливий (перитрих). В мазках з патматеріалу має вигляд довгих ниток до 500 мкм.

Сl. novyi та Cl. histolyticum спору утворюють тільки у зовнішньому середовищі, яка розміщується центрально або субтермінально, рухливі.

Таким чином, мікроскопія дає змогу лише зорієнтуватись відносно наявності патогенних анаеробів у матеріалі. Визначити видову належність збудника можна тільки ізолювавши його у чистій культурі. Крім клостридій при мікроскопії досить часто можна виявити стафілококи, стрептококи.

Культуральні властивості. Суспензію, одержану з патматеріалу, висівають на середовище Кітта-Тароцці. Інкубують в анаеробних умовах і, як правило, спостерігають ріст змішаної культури. Для одержання чистих культур роблять пересів на кров’яний МПА за методом Дригальського, отримують ізольовані колонії і роблять з них відсіви для ідентифікації збудників.

Cl. perfringens зумовлює помутніння бульйону та газоутворення через 16–24 год. Через 2–3 дні мікробна маса осідає на дно, а бульйон стає прозорим. На кров’яному агарі збудник утворює випуклі, з рівними краями колонії, навколо колоній – зону альфа-гемолізу з зеленуватим відтінком.

Сl. septicum також зумовлює помутніння середовища Кітта-Тароцці та газоутворення. Через 48 год бульйон стає прозорим, на дні утворюється осад. На глюкозокров’яному агарі утворюються ніжні блискучі з нерівними бахромчатими краями колонії, навколо яких – зона бета-гемолізу.

Сl. novyi зумовлює слабке помутніння рідкого середовища з незначним газоутворенням. Через 18–24 год бульйон стає прозорим, на дні з’являється осад у вигляді пластівців. На твердому живильному середовищі утворюються великі, соковиті, з нерівними краями колонії з зоною бета-гемолізу.

Сl. histolyticum викликає значне помутніння середовища Кітта-Тароцці без газоутворення. Пізніше воно стає прозорим, утворюється осад. На глюкозокров’яному агарі спостерігаються колонії-росинки. Зона гемолізу відсутня.

Біохімічні властивості.

Сl. perfringens – інтенсивно проявляються цукролітичні властивості, а саме, ферментує з утворенням кислоти та газу лактозу, сахарозу, мальтозу. Типовим для цього мікроба є характер звертання молока – утворюється губчатий згусток казеїну, який завдяки пухирцям газу піднімається нагору.

Сl. septicum – інтенсивно виражені цукролітичні властивості – ферментує глюкозу, лактозу з утворенням кислоти та газу. Протеолітичні властивості виражені слабо.

Сl. novyi володіє цукролітичними властивостями не однаково, в залежності від сероваріантів, але усі ферментують гліцерин. Протеолітична активність збудника також незначна.

Сl. histolyticum – цукри не ферментує. Збудник має виражені протеолітичні властивості: розріджує желатину, коагулює сироватку крові, пептонізує молоко.

Біопроба. Суспензію патологчного матеріалу морським свин-кам вводять підшкірно або внутрішньом’язево. При наявності збудників злоякісного набряку тварини гинуть протягом 16–48 год. На місці ін’єкції у них – кров’яний набряк, крапкові крововиливи. Підшкірна клітковина набрякла й геморагічно інфільтрована, м’язи темно-червоного кольору, присутні ознаки газоутворення. Трупи розтинають, роблять мазки-відбитки з місця ін’єкції та поверхні печінки. Інколи біопробу ставлять з метою оцінки вірулентності збудника. Добову бульйонну культуру морським свинкам вводять підшкірно чи внутрішньом’язево в дозі 0,5–1 мл. Свинки гинуть з вищеназваними ознаками.

Серологічна ідентифікація збудників. З метою ідентифікації збудників використовують реакцію нейтралізації (за Ерліхом) зі специфічною антитоксичною сироваткою. Мінімальну, смертельну для морських свинок дозу культури або її фільтрату змішують з 0,2–0,5мл відповідної типоспецифічної сироватки й витримують у термостаті протягом 45 хв. Після чого вводять гризунам підшкірно або внутрішньочеревно. Для контролю одночасно вводять культуру або фільтрат, не оброблені специфічною сироваткою. Вид збудника визначають за сироваткою, яка “захищає” морських свинок від загибелі, тобто нейтралізує його токсини. Усі інші та контрольні тварини гинуть.

Збудники брадзоту – Cl. septicum, Cl. novyi

– викликають гостре, неконтагіозне захворювання овець і кіз, що характеризується геморагічним запаленням сичуга й дванадцятипалої кишки, судомами, високою летальністю. Для бактеріологічної діагностики у лабораторію надсилають сичуг та дванадцятипалу кишку з вмістом, ексудат з грудної та черевної порожнини, некротичні ділянки печінки. Матеріал повинен бути абсолютно свіжим, відібраним зразу ж після загибелі тварини. Порядок дослідження такий, як і при діагностиці злоякісного набряку.

Збудник анаеробної ентеротоксемії овець – Cl. perfringens типів D і C. Викликає брадзотоподібне неконтагіозне захворювання овець усіх вікових груп, що характеризується геморагічним ентеритом, нервовими явищами, ураженням нирок, загальною інтоксикацією. У практиці нерідко захворювання називають “розм’якшена нирка”. У лабораторію надсилають уражені нирки та відрізки уражених кишок з вмістом, ексудат з черевної порожнини. Порядок дослідження такий же.

Збудник анаеробної дизентерії ягнят – Cl. perfringens типу В викликає гостру токсикоінфекцію новонароджених ягнят, яка характеризується геморагічним запаленням кишечника, діареєю. У лабораторію надсилають труп або кишечник з вмістом. Мазки фарбують за Грамом, висівають на середовище Кітта-Тароцці (роблять пересів два-три рази для виділення чистої культури анаеробів). З вмісту кишечника безпосередньо виділяють токсин. Для цього вміст змішують з подвійною кількістю ізотонічного розчину, екстрагують, фільтрують або осаджують на центифузі. Специфічність отриманого токсину визначають за допомогою типоспецифічних сироваток в реакції нейтралізації за Ерліхом.

 

Тема 7. Лабораторна діагностика правця, ботулізму,

Некробактеріозу

 

Збудник правця (стовбняка) – Cl. tetani викликає гостре інфекційне неконтагіозне захворювання тварин та людини, що характеризується підвищеною рефлекторною збудливістю, клонічними і тонічними скороченнями мускулатури тіла або окремих груп м’язів, високою смертністю, зумовлене продукцією надзвичайно сильного екзотоксину. Захворювання розвивається в результаті попадання збудника у рани. Хвороба може виникнути після родових травм, кастрації, обрізання хвостів або пуповини у новонароджених, якщо при цих операціях були порушені правила асептики та антисептики.

Патологічний матеріал направляють при сумнівних випадках. У лабораторію надсилають відібраний запальний ексудат з рани, шматочки тканин, взяті з глибини ураженої ділянки.

Мікроскопія. У мазках фарбованих за Грамом виявляють тоненькі (4–8 мкм), розміщені поодиноко, грампозитивні, рухомі палички, частина яких утворила спору. Спора, як правило, розміщується термінально, діаметр спори перевищує діаметр вегетативної клітини, надаючи форму барабанної палички. Капсул збудник не утворює.

Культуральні властивості. З метою знищення посторонньої мікрофлори перед посівом матеріал прогрівають протягом години при 80⁰С. Посів здійснюють пастерівською піпеткою в середовище Кітта-Тароцці. При наявності збудника середовище мутніє, а через 72 годин стає прозорим, відмічають слабке газоутворення, характерний запах. З рідкого середовища роблять пересів на глюкозокров’яний агар, на якому збудник утворює ніжні колонії з випуклим центром і нерівними краями, інколи – маленькі круглі колонії.

Біохімічні властивості виражені слабо і не мають діагностичного значення.

Біопроба має основне діагностичне значення. Ставлять її на білих мишах або морських свинках. Тварин заражають з метою вияву екзотоксину у патологічному матеріалі, а також у виділеній культурі. Для вияву екзотоксину у патологічному матеріалі, останній розтирають у ступці, заливають подвійною кількістю фізіологічного розчину й залишають на годину. Фільтрують через ватно-марлевий чи паперовий фільтр. Фільтрат вводять підшкірно двом-трьом білим мишам або морським свинкам. При наявності токсину Cl. tetani через два-три дні у тварин спостерігають характерні ознаки. Вони гинуть у характерній позі з витягнутими кінцівками.

З метою вияву токсину одержану культуру фільтрують, центрифугують для відокремлення бактерій. Надосадову рідину вводять у дозі 0,3–0,5 мл білим мишам чи морським свинкам підшкірно. При наявності токсину тварини гинуть через 2–5 діб з характерними клінічними ознаками.

Ідентифікація токсину. Змішують в однаковій кількості фільтрат з протиправцевою сироваткою й витримують у термостаті 40 хв. Вводять лабораторним тваринам. Якщо вони не загинули, значить у фільтраті є токсин.

 

Збудник ботулізму

 

Ботулізм – кормове (харчове) отруєння, кормова токсикоінфекція, зумовлена токсином Cl. botulinum. Захворювання характеризується ураженням центральної нервової системи, розвитком парезів, паралічів, летальністю 80–100%.

Патологічний матеріал. Бактеріологічна діагностика ботулізму полягає у виявленні ботулінічних токсинів, а також самого збудника. У лабораторію надсилають проби корму (силос, зерно, дерть, м’ясні і рибні відходи тощо), вміст шлунку, відрізки кишок з вмістом.

Проби корму і вміст шлунка ретельно розтирають у ступці з стерильним піском чи склом, заливають подвійною кількістю фізрозчину й використовують для вияву токсину і виділення збудника.

Вияв ботулінічного токсину. Підготовлену пробу витримують 1–2 год при кімнатній температурі, фільтрують через фільтр Зейтця (ватно-марлевий фільтр або осадити на центифузі) і поділяють на три частини. Одну частину вводять лабораторним тваринам підшкірно – при наявності токсину тварини гинуть; другу прогрівають при 80⁰С 30 хв і вводять морським свинкам – токсин термолабільний, при прогріванні розрушується, морські свинки повинні залишитись живими; третю використовують для встановлення специфічності токсину: її змішують з полівалентною антитоксичною сироваткою антиботулінус, витримують у термостаті 1–2 год, потім суміш вводять підшкірно морським свинкам – якщо у фільтраті міститься токсин, він нейтралізується специфічною сироваткою (антитоксинами), тварини залишаються живими. Такий результат дає підставу для заключного діагнозу – ботулізм.

Мікроскопія. Збудник – крупна (4–6 мкм), рухома, грампозитивна паличка, розміщується поодиноко або скупченнями. Утворює стійку спору (витримує кип’ятіння 5–6 год), яка розміщується термінально (рідко субтермінально) овальної форми, що нагадує тенісну ракетку. Капсул не утворює.

Культуральні властивості. Посів роблять на середовище Кітта-Тароцці або кров’яний агар. Культивують в анаеробних умовах. У рідкому середовищі збудник зумовлює помутніння, потім – утворення осаду й прояснення рідини, газоутворення. На агарі утворюються колонії неправильної форми з відростками, навколо яких – зона гемолізу.

 

Збудник некробактеріозу

Збудник некробактеріозу (фузобактеріозу) – Fusobacterium necrophorum викликає інфекційне захворювання з ознаками гнійно-некротичного розкладу тканин у більшості кінцівок. Інколи процес генералізується. При цьому утворюються метастази – некротичні вогнища у печінці, легенях, нирках тощо.

Патологічним матеріалом являється уражена тканина, відібрана на межі з неураженою. Некротизовану тканину розтирають у ступці з невеликою кількістю фізрозчину і використовують для виділення чистої культури.

Мікроскопія. Мазки фарбують за Грамом. Збудник у мазках з патматеріалу має вигляд ниткоподібних ланцюжків, фарбується нерівномірно. У мазках з культури – тонка, нерухома, грамнегативна паличка, спор і капсул не утворює.

Культуральні властивості. Збудник є анаеробом, тому посів матеріалу здійснюють на середовище Кітта-Тароцці. Інкубують протягом двох-трьох діб при 37⁰С. Збудник зумовлює помутніння середовища.

Біопроба. Чисту культуру із забрудненого постороньою мікрофлорою патматеріалу отримати важко, тому поступають так: суспензією некротизованої тканини заражають кроля. Після його загибелі труп розтинають, із осередків уражених внутрішніх органів проводять посіви на живильні середовища, готують мазки-відбитки з ураженого осередка. Для біопроби використовують також білих мишей, вводячи культуру чи суспензію патматеріалу підшкірно. Гризуни гинуть на 6–10 день.

 

Тема 8. Збудник ешеріхіозу

 

Ешеріхіоз (колібактеріоз, коліентеротоксемія) – гостре інфекційне захворювання новонароджених тварин, різних видів (включаючи птахів і хутрових звірів). Характеризується профузним проносом, зневодненням організму, депресією, слабкістю, явищами септицемії й токсемії. Хвороба перебігає у трьох клінічних формах: септичній, ентеротоксемічній та ентеритній. Прояв тієї чи іншої фо-рми залежить від токсинів, продукованих збудником. Телята сприй-нятливі у перші години і дні після народження; поросята хворіють як у період новонародженості, так і після відйому. Крім того, у поросят зустрічається ще одна форма ешеріхіозу – набрякова хвороба. Птахи уражуються в основному у перші 2–4 міс. Дорослі тварини колібакте-ріозом не хворіють, але являються бактеріоносіями патогенних шта-мів збудника.

Патологічний матеріал. У лабораторію надсилають свіжий труп або відбирають від нього трубчасті кістки, селезінку, шматок печінки з жовчним міхуром, лімфатичні вузли брижі, головний мозок. Окремо надсилають перев’язану з двох кінців ділянку ураженого тонкого кишечнику. При діагностиці колібактеріозу птиці одночасно із свіжими трупами відправляють п’ять-шість живих хворих особин, яких забивають у лабораторії й відбирають необхідний матеріал.

Мікроскопія. Із патологічного матеріалу готують звичайні мазки і кляч-препарати, які фарбують за Грамом. Е. соlі – коротка (2–3 мкм), товста, грамнегативна поліморфна паличка із заокругленими кінцями, розміщується поодиноко, рухлива (перитрих), не утворює спор. Окремі серотипи з підвищеною вірулентністю можуть утворю-вати капсулу.

Культуральні властивості. Із патологічного матеріалу пастерівською піпеткою здійснюють посів на МПА і МПБ у пробірках, а також на диференційні середовища Ендо і Левіна у бактеріологічних чашках. Для цього притримуючи стерильним пінцетом, стерильними ножицями вирізають шматочок органів і розрізаною поверхнею доторкуються поверхні середовища. Засіяні пробірки і чашки витримують у термостаті протягом 18–24 год при 37⁰С. В МПБ ешеріхії зумовлюють інтенсивне рівномірне помутніння середовища. На МПА утворюються колонії S-форми, округлі з рівними краями, гладкою, блискучою поверхнею, сіруватого кольору.

При підозрі на набрякову хворобу поросят матеріал висівають на МПА з кров’ю. У позитивному випадку навколо колоній утворюється зона бета-гемолізу.

Біохімічні властивості у ешеріхій досить виражені. З метою їх вивчення, виділену з органів молоду культуру, висівають на барвистий ряд. Останній включає диференційно-діагностичні середо-вища Гіса з лактозою, манітом, цитратно-амонійне середовище Сімонса, Ендо, Левіна, МПЖ. Мікроб ферментує до кислоти і газу глюкозу, лактозу, маніт, мальтозу. Продукує індол, не виділяє сірководень. Коагулює молоко без пептонізації згустку. Не розщеплює сечовину та нітрати, у зв’язку з чим не росте на середовищі Сімонса, не розріджує желатину.

На середовищі Ендо, до складу якого входять звичайний МПА, лактоза та індикатор (фуксин, знебарвлений сульфітом натрію), колонії набувають темно-малинового кольору з металевим блиском. Причиною забарвлення колоній є здатність ешеріхій ферментувати лактозу (на відміну від сальмонел, які інертні до цього вуглеводу), при цьому утворюється молочна кислота, під дією якої відновлюється колір фуксину, який надає колоніям відповідний колір. На середовищі Левіна кишкова паличка утворює колонії фіолетового або чорного кольору. Існують і лактозонегативні штами ешеріхій.

Біопроба проводиться з метою визначення патогенності виді-лених культур. Використовують дві культури виділені з внутрішніх органів і вирощені на МПА. Культуру змивають фізіологічним роз-чином і вводять у черевну порожнину трьом білим мишам. Якщо протягом двох діб після зараження загине хоча б одна миша, культуру вважають патогенною.

Біопробу на курчатах ставлять у випадку виділення збудника у птиці. Трьом курчатам 4–5-тижневого віку у черевну порожнину вводять змив добової агарової культури. Культуру відносять до патогенної, якщо протягом перших чотирьох днів після зараження загине хоча б одне курча.

Серологічна типізація ешеріхій основана на антигенній будові мікробної клітини. Антигенна структура кишкової палички складна. Виявлено три типи антигенів: О-антиген – соматичний, термоста-більний, міститься у клітинній стінці; Н-антиген – джгутиковий, термолабільний, знаходиться у джгутиках; К-антиген – поверхневий, зв’язаний з капсулою та оболонкою. За останніми даними у кишкової палички виявлено 150 різновидів О-антигенів, 99 – К-антигенів і 50 – Н-антигенів. Відповідно до такої кількості існує адекватна кількість серологічних типів ешеріхій. При позначенні повної антигенної структури конкретного серотипу антигени відділяють двома крапками, вказуючи при цьому їх порядковий номер, наприклад, О141: К85: Н10. Антигеном кожного типу гіперімунізують кролів, отримують специфічні аглютинуючі сироватки. В лабораторіях проводять лише серологічну типізацію кишкової палички по О-антигену.

З цією метою вирощену на МПА культуру змивають фіз-розчином і прогрівають на водяній бані при 100⁰С протягом години або автоклавують для руйнування термолабільних Н і К-антигенів. Прогріті культури ділять на дві частини. Першу використовують, як антиген для РА на склі, другу – як антиген для пробіркової РА.

У краплю полівалентної колі-сироватки бактеріологічною петлею вносять перший антиген і ретельно перемішують до одержання рівномірної суспензії. У позитивних випадках протягом перших трьох хвилин утворюються дрібні крупинки – пластівці аглютинату.

Всі культури, які дали позитивну реакцію аглютинації на склі, досліджують у пробірковій РА з монорецепторними сироватками, які входять до складу полівалентної сироватки.