Хроматографические методы анализа.

С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале широко

используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.

Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществляется просматриванием их в УФ свете.

При этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы и их 7-гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен.

Изофлавоны при этом не проявляются.

После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать одним из реактивов:

1) 5 %-ным спиртовым раствором AlCl₃ c последующим нагреванием при 105 ⁰С в течение 3-5 минут; (ярко-желтая окраска пятна в видимом свете и яркую желто-зеленую флуоресценцию в УФ –свете);

2) с 5 %-ной SbCl₃ в четыреххлористом углероде (реактив Мартини-Беттоло); Желтая или желто-оранжевая окраска указывает на наличие флавонов, флавонолов, флаванонов и изофлавонов;красная или красно-фиолетовая – халконов.

3) с 2 %-ным спиртовым раствором щелочи

4) при обработке пятна парами аммиака усиливается голубая флуоресценция (изофлавоноиды)

что позволяет получить зоны с более яркой флуоресценцией в УФ свете.

Реактив Вильсона (раствор борной и б\в лимонной кислоты в б\в метаноле)

5) Реакция азосочетания – на наличие 7-оксифлаванолов, 7-оксиизофлаванолов.

 

Количественное определение.

В последние годы все большее распространение получают различные:

1. физико-химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья.

К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.

1. Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.

Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения, так как в данном случае исключается стадия элюирования.

2. фотоэлектроколориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде, в реакции азосочетания с солями диазония.

ГФ Х1 издания дает ФЭК-метод для определения содержания суммы флавоноидов в листьях вахты трехлистной. Предварительно сырье очищают от хлорофилла хлороформом, получают спиртовое извлечение флавоноидов, затем измеряют оптическую плотность окрашенного раствора с помощью фотоэлектроколориметра. Содержание суммы флавоноидов рассчитывают по калибровочному графику, построенному по стандартному образцу рутина.

Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцитином.

В настоящее время широко используется метод спектрофотометричекий.

Спектрофотометрический метод (СФМ)

СФМ основан на способности флавоноидов или их окрашенных комплексов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны.

1) Получают спиртовое извлечение и измеряют собственное поглощение в:

- цветках бессмертника песчаного при длине волны 315 нм, рассчитывают содержание флавоноидов на изосалипурозид с использованием оптической плотности ГСО изосалипурозида;

- корнях стальника при длине волны 260 нм; рассчитывают на ононина;

- цветках пижмы измеряют оптическую плотность флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в буферном растворе и пересчитывают на лютеолин с учетом оптической плотности ГСО лютеолина;

2) Получают спиртовое извлечение, затем проводят реакцию образования комплекса с 2 %-ным раствором алюминия хлорида и измеряют оптическую плотность в:

- траве зверобоя в пересчете на рутин с учетом оптической плотности ГСО рутина;

- траве горца перечного в пересчете на кверцетин с учетом удельного показателя поглощения комплекса кверцетина с алюминия хлоридом;

- траве горца птичьего в пересчете на авикулярин с учетом удельного показателя поглощения комплекса авикулярина с алюминия хлоридом.

3) Получают извлечение антоцианов 1 %-ным раствором хлористоводородной кислоты из цветков василька синего, при этом образуются окрашенные оксониевые соли, у которых измеряют оптическую плотность и пересчитывают на 3,5 дигликозид цианидина (цианин) с учетом удельного показателя поглощения цианина в 1 %-ном растворе хлористоводородной кислоты.

Хроматоспектрофотометрический метод.

1. Предварительное разделение флавоноидов в тонком слое сорбента (цветки боярышника). Стадии определения:

- получение спиртового извлечения;

- очистка извлечения;

- хроматографическое разделение флавоноидов на пластинке «Силуфол» в системе растворителей хлороформ-метанол 8:2 вместе со свидетелем ГСО гиперозида;

- идентификация гиперозида и свидетеля на пластинках в УФ-свете;

- элюирование гиперозида и ГСО смесью диоксана и воды 1:1;

- измерение оптической плотности испытуемого раствора и ГСО при длине 565 им;

- расчет содержания гиперозида.

1. Предварительное разделение на колонке с полиамидом (плоды боярышника)

Стадии определения:

- получают спиртовое извлечение;

- отгоняют спирт и обрабатывают остаток 10%-ным раствором натрия хлорида;

- полученный раствор наносят на колонку с полиамидом;

- элюируют флавоноиды с колонки 95%-ным этанолом, собирают окрашенный в желтый цвет элюат в мерную колбу на 25 мл;

- измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 365 нм;

- параллельно измеряют оптическую плотность элюата ГСО гиперозида, полученного аналогично элюату флавоноидов;

- пересчитывают на гиперозид с учетом оптической плотности элюата ГСО

гиперозида.

3. В траве сушеницы топяной выделяют следующие стадии количественного определения:

- получают спиртовое извлечение;

- отгоняют спирт и остаток обрабатывают 10%-ным раствором натрияхлорида;

- полученный раствор переносят на колонку с полиамидом;

- элюируют флавоноиды с колонки 95%-ным этанолом и собирают окрашенный в темно-желтый цвет элюат в мерную колбу на 50 мл;

- измеряют оптическую плотность элюата при длине волны 338 нм;

- параллельно определяют оптическую плотность раствора стандартного вещества сравнения (СОВС) калия бихромата;

- пересчитывают на гнафалозид А с учетом оптической плотности СОВС и

коэффициента пересчета калия бихромата на гнафалозид А и поправочного

коэффициента на неполное элюирование гнафалозида А с полиамидного сорбента.

4. Количественное содержание ксантонов в траве золототысячника:

- получают извлечение подкисленным 60%-ным этанолом;

- 2 мл извлечения наносят на колонку с полиамидным сорбентом;

- элюируют ксантоны 95%-м этанолом и собирают окрашенный в желтый цвет элюат в мерную колбу на 50 мл;

- получают окрашенный комплекс с алюминия хлоридом;

- измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса;

- параллельно измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса ГСО алпизарина с алюминия хлоридом;

- пересчитывают на алпизарин с учетом оптической плотности комплекса ГСО алпизарина с алюминия хлоридом.

 

Количественное определение.

В последние годы все большее распространение получают различные:

1. физико-химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титрометрическими методами, а именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья.

К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.

Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме.

Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения, так как в данном случае исключается стадия элюирования.

Используется фотоколориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.

Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцитином.

В настоящее время широко используется метод спектрофотометричекий.

Методы анализа кумаринов

Для обнаружения кумаринов в растительном сырье проводят качественные реакции и хроматографическое исследование, используя лактонные свойства кумаринов:

- вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);

- давать окрашенные растворы с диазосоединениями;

- флуоресцироватьв УФ-свете.

Качественный анализ

1. Лактонная проба (предложена Г.А.Кузнецовой). Параллельно проводят контрольный опыт.

Методика: 1 мл извлечения, содержащего кумарины, наливают в две пробирки.

В одну добавляют 0,5 мл 10%-ного раствора натрия гидроксида.

Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют 4 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают.

Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит, реакция положительная, так как образуется желтая растворимая в воде соль кумаровой кислоты.

В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок.

При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается и кумарины выпадают в осадок.

 

 

2. Реакция образования азокрасителя. Реакция проводится с продуктами, полученными после реакции разрыва лактонного кольца.

Методика: В пробирку добавляют 1 мл свежеприготовленного диазореактива. Чаще всего, в качестве диазореактива используют диазосульфаниловую кислоту. Образуется азокраситель от желтого до вишнево-красного цвета.

 

1. Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной хроматографии. При этом используют системы растворителей:

- н-бутанол-уксусная кислота-вода БУВ (4:1:5)

- н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);

- петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);

Идентифицируют кумарины по характерной флюоресценции в УФ свете или проявляют хромогенными реактивами.

В качестве проявляющих реактивов служат 1%-ный спиртовый раствор алюминия хлорида, 10%-ный раствор щелочи или пары аммиака.

Широкие возможности для обнаружения в растениях и сырье кумаринов, не только их суммы, но и отдельных соединений, открылись после внедрения хроматографического анализа. При этом указанные реактивы используют и для обработки хроматограмм.

4. Хроматографические методы удобны для выделения индивидуальных кумаринов.

Количественное определение.

Для количественного определения кумаринов в лекарственном РС используют гравиметрические, титриметрические и физико- химические методы анализа.

По существующей нормативной документации для количественного определения кумаринов в лекарственном растительного сырье используют физико-химические методы анализа.

1. Полярографический метод. Определение кумаринов в плодах пастернака.

Основан на восстановлении кумаринов на ртутно-капельном электроде в альфа-пироновом кольце по месту двойной связи в положении 3,4. Присоединяют галоген - йод, в качестве реактива используют тетраэтиламмоний йодид. Содержание комариное в пересчете на ксантотоксин не менее 1%.

1. Спектрофотометрический метод. Основан на способности кумаринов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны в зависимости от концентрации исследуемого раствора. Используют

для определения содержания простых кумаринов в траве донника лекарственного (не менее 0.4%) и пиранокумаринов в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского (не менее 3 %). Получают хлороформное извлечение из сырья и измеряют у него оптическую плотность с помощью спектрофотометра.

3. Хроматоспектрофотометрический метод. Применяют для определения содержания фуранокумаринов в плодах амми большой, псоралеи костянковой, листьях инжира.

Стадии определения:

1. Получение хлороформного извлечения из сырья.

2. Разделение суммы кумаринов методом хроматографии на бумаге в системе растворителей, указанной в нормативной документации.

3. Идентификация кумаринов в УФ-свете по характерному свечению.

4. Элюирование веществ с бумаги. Каждое вещество отдельно элюируют 95 %-ным этанолом.

5. Измерение оптической плотности растворов с помощью спектрофотометра при длине волны, указанной в нормативной документации.

6. Расчет содержание каждого соединения с учетом удельного показателя поглощения.

Плоды амми большой: бергаптена и изопимпинеллина не менее 0,6 %.

Плоды псоралеи костянковой: псоралена и изопсоралена не менее 0,9 %.

Листья инжира: псоралена и бергаптена не менее 0,7%, отдельно псоралена менее 0,42 %.

4. Гравиметрический (весовой) метод.

Основан на избирательной растворимости отдельных кумаринов в различных растворителях и способности лактонного кольца кумарина к раскрытию и обратному замыканию в зависимости от рН среды.

Используется редкотолько для определения суммы кумаринов.

5. Фотоэпектроколориметрический метод.

Основан на измерении оптической плотности окрашенного раствора, полученного по реакции азосочетания с солями диазония при определенной длине волны.

Содержание суммы кумаринов рассчитывают по калибровочному графику, построенному по известному веществу.

Алкалоиды - Различают

общие качественные реакции, с помощью которых доказывается присутствие алкалоидов в сырье или в извлечении из сырья, и

частные качественные реакции, с помощью которых доказывают или индивидуальный алкалоид или определенную группу алкалоидов.

Общие реакции –

это либо реакции осаждения, либо реакции окрашивания.

Реакции осаждения основаны на способности алкалоидов к комплексообразованию. Образующиеся комплексы нерастворимы или мало растворимы в воде.

Общеалкалоидные осадочные реактивы можно разделить на несколько групп:

1 группа. Йод и его растворы.

Образуют с алкалоидами перйодиды, плохо растворимые в воде:

1) пары йода используют для открытия алкалоидов на хроматограммах;

2) раствор йода в KJ (реактив Вагнера, реактив Бушарда).

С алкалоидами образуют бурые, трудно растворимые в воде осадки.

 

2 группа. Комплексные йодиды металлов:

1) Реактив Драгендорфа - калия тетрайодовисмутат (KBiJ₄) - образует оранжевые или красно-бурые нерастворимые осадки.

Реакцию с реактивом Драгендорфа, согласно действующей НД, используют для обнаружения (проявления) алкалоидов крестовника плосколи стного на хроматограмме.

2) Реактив Майера - тетрайодомеркурат калия (K₂HgJ₄) - образует осадки белого или желтоватого цвета.

Реакцию с реактивом Майера широко используют для проверки полноты экстракции алкалоидов при их количественном определении в сырье красавки обыкновенной, белены черной, дурмана обыкновенного, анабазиса безлистного.

3 группа. Реакгивы комплексных неорганических кислот (высокомолекулярные органические вещества кислого характера):

1) Реактив Бертрана - раствор кремневольфрамовой кислоты

(SiO₂. 12 WO₃ . 4 H₂O) - образует белый аморфный осадок. Реакцию с реактивом Бер трана используют:

- для подтверждения наличия алкалоидов в извлечении из листа барба­риса и травы пассифлоры (качественные реакции);

- для проверки полноты экстракции алкалоидов при их количественном определении в траве плауна-баранца и чистотела, листьях и корнях барбариса;

2) реактив Шейблера - раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (НзРО₄.12 WО₃. 2Н₂О) - образует белые аморфные осадки;

3) реактив Зоненштейна - раствор фосфорно-молибденовой кислоты (НзРО₄ • 12МоОз 2Н₂О) - образует желтоватые аморфные осадки.

Все эти реактивы высокочувствительны и часто используются в исследовательских работах.

4 группа. Органические вещества кислотного характера:

1) раствор пикриновой кислоты - дает осадки желтого цвета.

Реакцию используют для осаждения алкалоида скополамина при его гравиметрическом определении в семенах дурмана индейского;

2) раствор танина - образует беловатые или бурые осадки.

Танин используют в качестве противоядия при отравлении алкалоидами. Танинблокирует поступление и всасывание алкалоидов.

 

Реакции окрашивания (частные реакции)