Принцип и предполагаемое использование продукта

БОЛЕЗНЬ АУЕСКИ

(ИНФИЦИРОВАНИЕ ВИРУСОМ БОЛЕЗНИ АУЭСКИ)

 

 

РЕЗЮМЕ

 

Возбудителем болезни Ауески, также известной под названием псевдобешенство, является альфагерпесвирус, который инфицирует центральную нервную систему и другие органы, такие как дыхательные пути, практически у всех млекопитающих, кроме людей и бесхвостых обезьян. Главным образом он ассоциирован со свиньями, его естественным хозяином, которые после выздоровления от клинической формы болезни остаются латентно инфицированными (за исключением поросят в возрасте младше двух недель, которые погибают от энцефалита). Контроль за болезнью осуществляется посредством локализации инфицированных стад, применения вакцин и/или удаления латентно инфицированных животных.

 

Диагностика болезнь Ауески осуществляется посредством обнаружения возбудителя (выделение вируса, полимеразная цепная реакция (ПЦР)), а также выявления серологической реакции у живых животных.

 

Идентификация агента. Выделение вируса болезни Ауески можно производить посредством инокуляции тканевого гомогената, например головной мозг и миндалины или материал, собранный из носа/глотки, в чувствительную линию клеток, такую как свиная почка (РК-15) или SK6, или первичные или вторичные клетки почки. Специфичность цитопатогенного действия подтверждают с помощью иммунофлуоресценции, иммунопероксидазного метода или реакции нейтрализации с использованием специфической антисыворотки. Идентификацию вирусной ДНК можно произвести с помощью ПЦР, это можно произвести методами ПЦР в реальном времени.

 

Серологические тесты. Обнаружение антител к вирусу болезни Ауески производят посредством реакции нейтрализации, латекс агглютинации или иммуноферментного анализа (ИФА). По всему миру в продаже есть ряд ИФА-наборов. Для рутинного тестирования в лабораториях, осуществляющих серологическую диагностику болезни Ауески, нижний предел чувствительности определяет международная стандартная сыворотка МЭБ.

С началом использования вакцин с делетированным геном появилась возможность дифференцировать антитела, вырабатываемые вследствие естественного заражения и вследствие вакцинации.

 

Требования к вакцинам. Вакцины должны предотвращать или, как минимум, ограничивать экскрецию вируса из инфицированных свиней. В рекомбинантных вакцинах, полученных из ДНК с делетированным геном, или в вакцинах на основе живого вируса Ауески, делетированного естественным образом, отсутствует специфический гликопротеин (gG, gE или gC), что позволяет использование сопутствующих диагностических тестов для проведения дифференциации между вакцинными антителами и антителами, образующимися в результате естественной инфекции.

 

А. ВВЕДЕНИЕ

 

Возбудителем болезни Ауески, также известной под названием псевдобешенство, является Suid herpesvirus 1 (SHV-1), член подсемейства Alphaherpesvirinae и семейства Herpesviridae. С вирусом в основном работают в лабораториях класса BSL-2. Вирус инфицирует центральную нервную систему и другие органы, такие как дыхательные пути, фактически у всех млекопитающих (таких как собак, кошек, КРС, овец, кроликов, лис, норок и т.д.), кроме человека и бесхвостых обезьян. Главным образом он ассоциирован со свиньями, его естественным хозяином, которые после выздоровления от клинической формы болезни остаются латентно инфицированными (за исключением поросят в возрасте младше двух недель, которые погибают от энцефалита). Как следствие свинья является единственным видом, способным выживать при продуктивной инфекции и, поэтому, служит хозяином-резервуаром. У свиней тяжесть клинических признаков зависит от возраста свиньи, пути инфицирования и вирулентности инфицирующего штамма и иммунологического статуса животных. Молодые поросята очень восприимчивы, у них уровень смертности достигает 100% в течение первых двух недель. У этих животных наблюдается повышенная температура и тяжелые неврологические нарушения: тремор, расстройство координации, атаксиия, нистагм до опистотонуса и тяжелые припадки, схожие с судорогами при эпилепсии. Если поросята старше двух месяцев (свиньи на доращивании и откорме), преобладают респираторные формы с повышением температуры, потерей аппетита, слабовыраженными до тяжелых респираторными признаками: ринит с чиханием и выделениями из носа, которые могут прогрессировать до развития пневмонии. Частота вторичных бактериальных инфекций высока, в зависимости от статуса здоровья инфицированного стада. В такой группе свиней заболеваемость может достигать 100%, но в случаях, когда осложненные вторичные инфекции отсутствуют, смертность варьирует в пределах 1-2% (Pejsak & Truszczynski, 2006). У свиноматок и хряков обычно наблюдается появление респираторных признаков, а у супоросных свиноматок вирус может преодолевать плаценту, инфицировать и убивать плод, вызывая аборт, повторение эструса и мертворождение. У других восприимчивых видов животных болезнь смертельна, преобладающим признаком является сильный зуд, приводящий к тому, что животное разгрызает или расчесывает часть тела, обычно голову или задние конечности, пока не развивается серьезное разрушение ткани. По этой причине эту болезнь в прошлом называли бешеный зуд.

 

Очаговые некротические поражения и поражения в виде энцефаломиелита возникают в головном мозге, мозжечке, надпочечниках и других внутренних органах, таких как легкие, печень или селезенка. У эмбрионов или очень молодых поросят патогномичными признаками инфекции этим вирусом являются белые пятна на печени. Внутриядерные поражения часто обнаруживают в нескольких тканях.

 

Болезнь Ауески является эндемичной во многих частях мира, но несколько стран провели успешную программу искоренения, например, Соединенные Штаты Америки, Канада, Новая Зеландия и многие страны-члены Европейского Союза.

 

Контроль болезни осуществляют посредством локализации инфицированных стад и использования вакцин и/или удаления латентно инфицированных животных (Pejsak & Truszczynski, 2006). Полный санитарный убой обычно использовался и используется в нескольких странах, если инфицированные фермы небольшого размера или если угроза для окружающих ферм слишком высока в свободных странах.

 

Тогда как выделение вируса болезни Ауески или выявление вирусного генома с помощью полимеразной цепной реакции используются для диагностики в случае летальных форм

болезни Ауески или клинического заболевания у свиней, серологические тесты требуются для диагностики латентных инфекций и после исчезновения клинических признаков. Пораженные животные, за исключением свиней, не живут достаточно долго, чтобы продуцировать какой-либо отчетливый серологический ответ. Серологические тесты являются методом, используемым для выявления субклинически или латентно инфицированных свиней, особенно в случае определения статуса здоровья животных для международной торговли или в других целях.

 

 

 

В. ДИАГНОCТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

 

Идентификация агента

 

а) Выделение вируса

 

Подтверждение диагноза, болезнь Ауески, можно произвести посредством выделения вируса из ротоглоточной жидкости, назальной жидкости (мазки) или мазков миндалин от живых свиней или из образцов, полученных от павших свиней или от свиней после появления клинических признаков, таких как энцефалит у травоядных или плотоядных. Для посмертного выделения SHV-1 предпочтительными образцами являются образцы головного мозга, миндалин или легких. У КРС инфекция обычно характеризуется зудом, в таком случае для выделения вируса может понадобиться образец соответствующего отдела спинного мозга. У латентно инфицированных свиней наиболее сообразным участком для выделения вируса является ганглий тройничного нерва, хотя обычно латентный вирус обычно является неинфекционным, пока он не реактивирован, что затрудняет его выделение в культуре.

 

Образцы гомогенизируют в нормальном физиологическом растворе или среде для культивирования клеток с добавлением антибиотиков, полученную суспензию осветляют посредством центрифугирования на низкой скорости при 900 g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость используют для инокуляции любой чувствительной системы культуры клеток. К SHV-1 чувствительны многочисленные линии клеток или первичные клеточные культуры, но обычно используется линия клеток почки свиньи (РК-15). Покрывающая среда для культур должна содержать антибиотики (такие как: 200 МЕ/мл пенициллина; 100 мкг/мл стрептомицина; 100 мкг/мл полимиксина и 3 мкг/мл фунгизона).

 

SHV-1 индуцирует цитопатогенное действие (ЦПД), которое проявляется в течение 24-72 часов, но культуры клеток можно инкубировать и в течение 5-6 дней. В монослое наблюдается образование скоплений двоякопреломляющих клеток с последующим полным отделением клеточного слоя. Также происходит образование синцитий различного внешнего вида и размера. При отсутствии любого видимого ЦПД рекомендуется провести один слепой пассаж на дополнительных культурах. Дополнительные подтверждения можно получить посредством окрашивания инфицированных культур на покровных стеклах гематоксилином и эозином с целью демонстрации характерных для герпесвируса ацидофильных внутриядерных включений, окаймленных хроматином. Идентичность вируса должна быть подтверждена посредством иммунофлуоресценции, иммунопероксидазного метода или реакции нейтрализации с применением специфической антисыворотки.

 

Выделение SHV-1 позволяет подтвердить наличие болезни Ауески, однако неудача при выделении не гарантирует свободы от инфекции.

 

b) Идентификация вируса посредством полимеразной цепной реакции

 

Для идентификации геномов SHV-1 в секретах или образцах органов можно использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Многие отдельные лаборатории разработали эффективные протоколы, но международно-признанного стандартизированного подхода еще не существует.

 

В основе ПЦР лежит избирательная амплификация специфической части генома с использованием двух праймеров, расположенных на каждом конце избранной последовательности. На первом этапе выделение полной ДНК можно произвести с помощью стандартных процедур (например, расщепление с помощью протеиназы К, экстрагирование с помощью фенол-хлороформа) или с помощью коммерческих наборов для экстрагирования ДНК. Используя циклы денатурации ДНК для получения матриц в виде одноцепочечной ДНК, гибридизацию праймеров и синтез комплементарных последовательностей с применением термостабильной ДНК-полимеразы, целевую последовательность можно амплифицировать до 106 раз. Праймеры должны быть созданы таким образом, чтобы амплифицировать последовательность, которая является консервативной среди штаммов SHV-1, например, были использованы части gB- и gD- генов, которые кодируют главные гликопротеины (Mengeling et al., 1992, Van Rijn et al., 2004, Yoon et al., 2006). Разработана ПЦР в реальном времени, которая способна дифференцировать gE-делетированные вакцинные вирусы от вирусов дикого типа посредством специфического обнаружения gВ и gE генов (Ma et al., 2008). Однако gE-специфичная ПЦР в реальном времени имеет более низкую чувствительность, чем gB-специфичная ПЦР в реальном времени.

 

Идентификацию амплифицированного продукта можно произвести по его молекулярному весу, который устанавливается при миграции в агарозном геле, с дальнейшим подтверждением, там, где возможно, посредством гибридизации с использованием саузерн-блоттинга с применением комплементарного зонда. В современных методах используется жидкостной гибридизация с меченными ферментом зондами, при которой после инкубации с соответствующим субстратом происходит цветная реакция. Более новые методы включают использование флуоресцентных зондов, связанных с действием экзонуклеазы и мониторинг в реальном времени за эволюцией продукта, что позволяет проводить одновременно амплификацию и подтверждение матричной ДНК, тем самым повышая скорость и специфичность анализов ПЦР.

 

Во всех случаях главным преимуществом ПЦР по сравнению с традиционными методами выделения вируса является его быстрота: при использовании современного оборудования можно произвести весь процесс идентификации и подтверждения в течение одного дня. Однако, учитывая природу теста, следует соблюдать многие меры предосторожности, чтобы избежать контаминации образцов чужеродными ДНК из предыдущих тестов или вследствие общей контаминации окружающей среды в лаборатории (смотри Главу I.1.9. Тесты биологических материалов на стерильность и свободу от контаминации). Это может ограничивать ценность теста для многих лабораторий, если не соблюдается осторожность в целях недопущения контаминации переносом ДНК. Использование внутреннего контроля необходимо для избежания ложноотрицательных результатов, посредством обеспечения надлежащей эффективности экстрагирования ДНК и подтверждения отсутствия ингибиторов ПЦР в каждой пробе. На практике, для выявления эндогенного или экзогенного гена можно применять различные системы (Hoffman et al., 2009).

 

Серологические тесты

 

Реакция нейтрализации вируса считается эталонным методом для серологии (Moennig et al., 1982), но для общих диагностических целей, её повсеместно заменяют иммуноферментным анализом (ИФА), т.к. данный тест пригоден для широкомасштабного тестирования (Moennig et al., 1982). Эти тесты можно проводить на различных матрицах (напр. сыворотке крови, цельной крови, мышечных экссудатах и фильтровальной бумаге), но предпочтительной матрицей является сыворотка крови.

 

Также разработана реакция латекс-агглютинации, данную реакцию можно использовать для массового обследования на наличие антител. Она позволяет дифференцировать иммунный ответ естественно инфицированных свиней и иммунный ответ свиней, которые подвергались вакцинации gE-делетированными вакцинами (Yong et al., 2005). В продаже есть наборы для проведения данного теста (Schoenbaum et al., 1990).

 

Серологические тесты проводятся только для свиней, так как другие животные (травоядные и плотоядные) умирают слишком быстро, и антитела не успевают вырабатываться. В свободных зонах, где свиньи не вакцинируются, можно проводить активный эпидемиологический надзор с использованием ИФА gB наборов. Так как антитела можно выявлять с 7 по 10 день после инфекции этот серологический метод можно также использовать в случае подозрения на вспышку для подтверждения наличия инфекции у свиней. В зоне, где свиней вакцинируют gE-делетированными вакцинами, наборы ИФА gE позволяют проводить дифференциацию между инфицированными и вакцинированными свиньями (стратегия DIVA), но для оценки напряженности иммунитета, индуцированного вакцинацией, следует использовать наборы ИФА gВ или реакцию вирус нейтрализации.

 

Любой используемый серологический метод должен быть достаточно чувствительным, чтобы давать положительный результат при применении международной стандартной эталонной сыворотки МЭБ. Данную сыворотку можно получить из Справочной лаборатории МЭБ по болезни Ауески во Франции (см. таблицу в Части 4 данного Руководства по наземным животным). Для международной торговли, тест должен быть настолько чувствительным, чтобы обнаруживать стандартную сыворотку, разведенную ½. Для разрешения перемещения свиней из зоны, где используются gE-делетированные вакцины, в свободную зону, серологические анализы должны быть способны выявлять, как минимум, разведение 1/8 для ИФА gE стандартной справочной сыворотки МЭБ, как это предписано Европейской Комиссией (2008 г.).

 

 

а) Реакция нейтрализации вируса (предписанный тест для международной торговли)

 

Нейтрализацию вируса в культуре клеток можно произвести несколькими путями, которые отличаются по продолжительности периода инкубации смесей вирус/сыворотка крови (например, 1 час при 37оС или 24 часа при 4оС) и по присутствию или отсутствию комплемента. В большинстве лабораторий используется реакционный период продолжительностью 1 час при 37оС при отсутствии комплемента, поскольку это легко и быстро. Однако чувствительность метода можно повысить, увеличив период инкубации до 24 часов при 4оС, что делает возможным обнаружение уровней антител в 10-15 раз ниже, чем при использовании первого метода, когда инкубация производится в течение одного часа. Для международной торговли данный тест-метод следует валидировать, как метод, обладающий

чувствительностью, достаточной для обнаружения стандартной справочной сыворотки МЭБ, разведенной ½.

 

Реакцию нейтрализации вируса нельзя использовать для дифференциации антител, индуцированных вакциной, и антител, индуцированных вследствие естественного заражения. Данный тест является одним из двух имеющихся тестов, соответствующих требованию, изложенному в главе Ветеринарно-санитарного кодекса МЭБ по наземным животным, когда его упоминают как «диагностический тест для цельного вируса».

 

i) Клетки

 

Используются клетки, чувствительные к заражению SHV-1; это могут быть клеточные линии (например, РК-15, SK6, MDBK) или первичные или вторичные культуры клеток.

 

ii) Среда для культивирования клеток

 

Выбор среды зависит от типа клеток. Например, средой для РК-15 клеток является минимальная поддерживающая среда Игла (MEM) + 10% фетальная телячья сыворотка и антибиотики (100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина или, альтернативно, 50 мкг/мл гентамицина).

 

iii) Поддержание клеток

 

Клетки культивируют в сосудах для культивирования клеток объемом, например, 75 см2. Один или два раза в неделю производят их трипсинизацию. Для трипсинизации один раз в неделю клетки обычно культивируют в 50 мл среды при скорости размножения равной 5. Для трипсинизации два раза в неделю клетки культивируют в 30 мл среды со скоростью размножения равной 3.

 

Для трипсинизации сразу же по завершении формирования пласта клеток ростовую среду удаляют. Пласт клеток промывают примерно 5 мл недавно оттаявшей трипсин/этилен-диамин тетрауксусной кислоты (ЭДТК) (0,25%) в изотоническом буфере. Жидкость для промывания удаляют, препарат промывают опять, сохраняя лишь несколько капель трипсина. Контейнер помещают в инкубатор при 37оС на 5-10 минут до тех пор, пока клетки не начнут отделяться. Сразу же после отделения слоя и явного разделения клеток для пассирования один раз в две недели производят их суспендирование в 90 мл ростовой среды и эту суспензию распределяют по трем флаконам для культивирования клеток объемом 75 см2. Если трипсинизацию осуществляют раз в неделю, то клетки суспендируют в 150 мл ростовой среды, а суспензию распределяют по пяти 75 см2 флаконам для культивирования клеток.

 

iv) Вирус

 

Подходящий штамм SHV-1, такой как штамм Kojnok или штамм NIA-3, хранят при температуре -65оС или ниже или в лиофилизированном виде при 4оС.

 

v) Приготовление исходной вирусной суспензии.

 

Из флакона для культивирования клеток, содержащего сформированный пласт клеток, удаляют культуральную жидкость. Добавляют около 1 мл исходной вирусной

суспензии с известным титром (около 107 ТЦД50/мл [50% доза инфицирования культуры ткани]), флакон инкубируют при 37±2оС в течение 1 часа. Затем, добавляют 30 мл культуральной среды, и флакон снова инкубируют при 37±2оС. Флакон часто обследуют, пока степень разрушения клеток не составит приблизительно 75% (примерно через 36-48 часов). Затем его замораживают при температуре -20оС или ниже для лизиса клеток.

 

Затем флаконы оттаивают и энергично встряхивают. Среду собирают и центрифугируют при 1500 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость разделяют на две порции (примерно по 0,5 мл) и помещают в маленькие пробирки, которые этикетируют (дата и данные о вирусе), а затем хранят при температуре -65оС или ниже, пока они не понадобятся.

 

vi) Титрование исходной вирусной суспензии

 

Титрование исходной суспензии осуществляют методом Рида-Мюнча или методом Кербера, титр выражают в расчете на 50 мкл или на мл.

 

Для проведения реакции нейтрализации вируса требуется контрольная сыворотка, используемая как внутренний качественный контроль, с известным титром нейтрализующих антител к SHV-1 (следует провести калибровку данной сыворотки по отношению к международной стандартной сыворотке или по отношению к вторичному стандарту, приготовленному из нее), отрицательная контрольная сыворотка (от не имеющей специфических антител свиньи, например из официально свободного от болезни Ауески стада). Тестируемые сыворотки сами по себе должны быть хорошего качества, четко этикетированы, известного происхождения с клинической историей, должны постоянно храниться в охлажденном виде, быть свободны от грибковой и бактериальной контаминации, не гемолизированы и быть в достаточном количестве. Сыворотку крови следует безотлагательно отделить от коагулянта, предотвратив тем самым токсичность.

 

Существуют качественная и количественная процедуры для нейтрализации вируса, обе процедуры описаны ниже.

 

Качественный метод

 

i i) Комплемент в образцах сыворотки разрушают посредством нагревания на водяной бане при 56-59оС в течение 30 минут.

 

 

i ii) Каждый образец неразведенной сыворотки помещают в две-три лунки, по 50 мкл в лунку, на 96-луночном титрационном микропланшете для культивирования клеток. Каждую сыворотку также можно развести ½ в МЕМ до помещения в две другие лунки.

 

 

i iii) В каждую лунку добавляют 50 мкл вирусной суспензии, содержащей 100 ТЦД50/50 мл (или 2х103 ТЦД50/мл), полученной посредством разведения исходной вирусной суспензии с известным титром с помощью минимальной поддерживающей среды Игла.

 

 

i iv) Планшет встряхивают и помещают в инкубатор на один час при 37оС (±2 оС) (присутствие 5% СО2 необязательно).

 

 

 

i v) В каждую лунку добавляют 150 мкл клеточной суспензии, содержащей примерно 150 000 клеток/мл.

 

 

i vi) Планшет покрывают (для инкубации в СО2) или осторожно запечатывают пластиковой пленкой по краям планшета (при инкубации на воздухе). Планшет слегка встряхивают для равномерного распределения клеток по дну лунок и помещают в инкубатор при 37оС (±2 оС) (присутствие СО2 необязательно) на 3 – 5 дней.

 

 

i vii) Контроли: Каждый набор планшетов должен включать следующие контроли.

 

 

a) Вирусный контроль

 

Используется для подтверждения количества вируса, фактически используемого для теста. Дозу вируса, используемую для реакции вирус нейтрализации (целевой титр 100 ТЦД50/мл) разводят минимальной поддерживающей средой Игла 1/10, 1/100 и 1/1000. Из каждого разведения 50 мкл помещают, как минимум, в четыре лунки, затем в каждую лунку добавляют по 50 мкл среды, затем лунки инкубируют в течение 1 часа при 37оС (±2 оС). Добавление суспензии клеток осуществляют таким же образом, как и добавление сыворотки, подлежащей тестированию.

 

b) Клеточный контроль

 

В каждую из, как минимум, четырех лунок помещают 150 мкл клеточной суспензии и 100 мкл минимальной поддерживающей среды Игла.

 

c) Контрольная положительная сыворотка

 

Используют сыворотку крови с известным титром нейтрализующих антител к SHV-1. Получают пять разведений таким же образом, как для сыворотки крови, подлежащей тестированию: разведение, соответствующее титру сыворотки крови, двукратное и четырехкратное разведения и разведения в ½ и в ¼ (эквивалентно Т, Т/2, Т/4, 2Т и 4Т, где Т – титр сыворотки крови, т.е. неразведенная сыворотка крови для качественного теста). К 50 мкл разведений положительного контрольного образца добавляют 50 мкл вирусной суспензии, содержащей 100 ТЦД50/50 мкл. Клетки инкубируют, клеточную суспензию добавляют так же, как и производят добавление сывороток крови, подлежащих тестированию.

 

d) Контрольная сыворотка крови

 

Используется для подтверждения отсутствия токсического воздействия сывороток крови на клетки. Лунки, содержащие 50 мкл каждой сыворотки крови, инкубируют в течение 1 часа при 37оС в присутствии 50 мкл среды. Затем, добавляют 150 мкл суспензии клеток таким же образом, как и сыворотки крови, подлежащие тестированию.

 

e) Отрицательная контрольная сыворотка крови

 

С ней производят те же манипуляции, что и с сыворотками крови, подлежащими тестированию.

 

i viii) Считывание результатов. Через 48 и 72 часа лунки обследуют на наличие токсического действия и цитопатогенного действия, используя микроскоп с инвертированным изображением (х100). Для признания тестов достоверными, контроли должны давать следующие результаты:

 

 

a) Вирусный контроль

 

Титр вирусной суспензии должен быть в пределах от 30 до 300 ТЦД50/50 мкл.

 

b)Клеточный контроль

 

Пласт клеток должен быть интактным.

 

c) Положительная контрольная сыворотка крови

 

Полученный титр должен быть равен прогнозируемому титру в рамках одного разведения.

 

d) Сывороточный контроль

 

При обследовании на наличие цитопатогенного действия следует принимать во внимание возможное токсическое воздействие на клетки.

 

e) Отрицательная контрольная сыворотка крови

 

Должно наблюдаться цитопатогенное действие.

 

i ix) Для тестируемых сывороток могут наблюдаться следующие результаты: присутствие ЦПД в трех лунках - отрицательный результат; отсутствие ЦПД в трех лунках на 3-ий день - положительный результат; присутствие ЦПД в одной лунке и отсутствие в других - сомнительный результат, тест необходимо повторить; маленькие бляшки, указывающие на наличие ЦПД в день 3 - сомнительный результат, тест необходимо повторить; токсичность в сывороточном контроле и тест-лунках - не поддающийся считыванию результат, тест необходимо повторить (NB: замена среды свежей средой через 16 часов инкубации снижает токсичность, не оказывая негативного влияния на титр специфических антител).Считывание планшетов можно производить до пятого дня инкубации. Если сыворотка крови изначально была разведена 1/2, они считается положительной, если ЦПД отсутствует в двух лунках. Разведение сыворотки крови до ½ может предотвращать токсическое воздействие тестируемой сыворотки крови.

 

 

i x) Интерпретация результатов. Данный тест способен обнаруживать присутствие или отсутствие нейтрализующих антител к SHV-1. Он не способен дифференцировать вакцинированных животных от инфицированных животных.

 

 

Описанный метод (реакция нейтрализации вируса в течение 1 часа при 37оС) может давать ложноотрицательные и ложноположительные результаты. Чувствительность метода можно повысить (это приводит к уменьшению количества ложноотрицательных результатов), приняв метод, в основе которого

лежит нейтрализация, включающая контакт между сывороткой крови и вирусом в течение 24 часов при 4оС перед добавлением клеток.

 

Качественный метод, такой как данный метод, в котором используется образцы неразведенной сыворотки крови (конечное разведение:½), может также в определенных случаях давать ложно положительные результаты из-за неспецифической нейтрализации вируса. Данную проблему можно решить, посредством проведения подтверждающего теста с использованием количественного метода (смотри ниже).

 

Количественный метод

 

Данный метод сходен с качественной процедурой, но каждая сыворотка крови используется как неразведенной, так и в серии разведений. В зависимости от желаемой степени точности, цели тестирования и ожидаемого титра для каждого разведения используются две лунки и больший или меньший диапазон разведений. В идеале можно описать процедуру для диапазона разведений, достигающего первоначального максимума в 1/256, с тремя лунками для каждого разведения.

 

i i) Разрушение комплемента в образцах сыворотки производят посредством нагревания на водяной бане при 56ос в течение 30 минут.

 

 

i ii) В лунки А3 до А6 на 96-луночном титрационном микропланшете для культивирования клеток добавляют 50 мкл минимальной поддерживающей среды Игла.

 

 

i iii) В лунки А1-А3 добавляют 50 мкл неразведенной сыворотки крови, и продолжают добавлять другие образцы сыворотки крови в лунки рядов В, С и т.д.

 

 

i iv) Используя многоканальную пипетку, содержимое лунок в ряде 3 перемешивают, затем 50 мкл переносят в лунки ряда 4 и так далее до ряда 6 или последующего предварительно определенного ряда, причем используются те же наконечники. Порции в 50 мкл, оставшиеся после последнего ряда выбрасывают.

 

 

i v) Размещение контролей производят как при качественном методе.

 

 

i vi) В лунки ряда 1 вместо вируса добавляют 50 мкл минимальной поддерживающей среды Игла: это контрольный ряд сывороток. В лунки других рядов добавляют вирусную суспензию. Последующие манипуляции такие же, какие описаны для качественного метода.

 

 

i vii) Считывание результатов. Нейтрализующий титр сыворотки выражают через знаменатель наивысшего первоначального разведения, дающего почти полную нейтрализацию ЦПД вируса в 50% лунок. Нейтрализация при любом разведении (даже в неразведенном виде, что эквивалентно конечному разведению в 1/2) считается положительным результатом. Если нейтрализация наблюдается только в неразведенных сыворотках (при наличии роста вируса и ЦПД при разведении в ½ и последующих разведениях), для подтверждения результата было бы целесообразно применить альтернативные тесты (ИФА или

 

 

i реакцию латекс-агглютинации) или попросить произвести еще один отбор образцов у животного, как минимум, через 8 дней после первого.

 

 

b) Иммуноферментный анализ (предписанный тест для международной торговли)

 

Чувствительность иммуноферментного анализа (ИФА) обычно выше, чем у реакции нейтрализации вируса, если процесс нейтрализации занимает 1 час и без комплемента. Некоторые слабоположительные сыворотки легче обнаружить в реакции нейтрализации вируса с использованием 24-х часового периода нейтрализации, тогда как другие легче обнаружить посредством ИФА.

 

В имеющихся в продаже ИФА-наборах для определения уровней антител используются непрямой или конкурентный методы. Они отличаются по способу подготовки антигена, конъюгата или субстрата, периоду инкубации и интерпретации результатов. Общим преимуществом их использования является возможность быстро обработать большое количество образцов. Процесс можно также автоматизировать и производить анализ результатов с помощью компьютера. С помощью некоторых из таких наборов при использовании «соответствующей» вакцины (Eloit et al., 1989; Van Oirschot et al., 1986) можно дифференцировать вакцинированных и естественно инфицированных животных. Альтернативно, возможно утверждение некоммерческих протоколов ИФА (Toma & Eloit, 1986), при условии, что в отношении них установлено, что они обнаруживают международную стандартную эталонную сыворотку МЭБ, в виде положительного результата при разведении в ½ (минимальная чувствительность для целей международной торговли). Рекомендуется использовать набор или внутренний тест, т.е. разработанный на месте, валидация которого по отношению к данному стандарту была произведена независимой лабораторией с использованием внешних тестов контроля качества. Ниже представлен подходящий протокол теста для выявления антител к цельному вирусу (Toma & Eloit, 1986).

 

Приготовление антигена

 

i i) Используется клеточная линия, чувствительная к SHV-1, такая как РК-15 или фетальный свиной семенник. Она не должна содержать посторонних вирусов, таких как вирус вирусной диареи КРС. За день до инокуляции клетки следует расщепить и высеять в свежие 75 см2матрасы. Культуры покрывают слоем из подходящей среды, такой как минимальная поддерживающая среда Игла без сыворотки крови.

 

 

i ii) Обработка матрасов, инокулированных вирусом, и контрольных, неинокулированных матрасов осуществляется параллельно в течение всего эксперимента. Используют подходящий хорошо охарактеризованный штамм SHV-1, например, штамм Kojnock. Когда сформировался конфлюэнтный клеточный монослой (приблизительно через 24 часа после посева), его инокулируют 108ТЦД50 SHV-1 в 5 мл среды, а в контрольные матрасы помещают 5 мл среды (без вируса). Культуры оставляют для адсорбции на 30 минут при 37оС, а затем поверх наносят слой среды, 20 мл.

 

 

i iii) Сразу же после начала развития цитопатогенного действия, надосадочную среду удаляют и добавляют 4 мл KCl (4 мМ раствор) и стеклянные гранулы. Затем матрасы осторожно встряхивают для отделения клеток.

 

 

 

i iv) Клетки отмывают посредством центрифугирования, 3 раза при 770 g в 4 мМ КСl. Осадок ресуспендируют в 4 мМ КСl с 2% Triton X-100 (1 мл на один матрас), производя 60 круговых движений стеклянным гомогенизатором.

 

 

i v) Клеточный гомогенат наносят слоем на 0,25 мМ сахарозу в 4 мМ КСl и центрифугируют в течение 10 минут при 770 g.  

 

 

i vi) Осадок ресуспендируют в буфере для разведения антигена, рН 9,6 (0,1 М Tris, 2мМ ЭДТК, 0,15 мМ NaCl) в объеме равном 1/50 объема первоначальной культуральной среды. Затем его можно хранить в небольших аликвотах при -70оС. В таком виде антиген остается стабильным в течение 2 лет.

 

 

2.2.2. Сенсибилизация титрационных микропланшетов

 

i i) Вирусный антиген и контрольный (без вируса) антиген разводят в буфере для разведения, рН 9,6 (смотри выше) до получения разведения, заранее определенного в титрованиях методом "шахматной доски".

 

 

i ii) В каждую лунку 96-луночного ИФА-планшета помещают 200 мкл антигена, сенсибилизируя ряды поочередно, то антигеном SHV-1, то контрольным антигеном. Инкубируют в течение 18 часов при 4оС.

 

 

i iii) Планшеты промывают три раза раствором для промывания (Твин 20, 0,5 мл/литр).

 

 

i iv) Покрытые планшеты хранят при -20оС или при -70оС. Они остаются стабильными в течение нескольких месяцев.

 

 

Процедура теста

 

i i) Образцы тестируемой сыворотки разводят 1/30 в ФБР/Твин буфере, рН 7,2 (137 мМ NaCl, 9,5 мМ фосфатный буфер, 0,5 мл/литр Твин 20).

 

 

i ii) Разведенные образцы добавляют в лунки, сенсибилизированные вирусным и контрольным антигеном, и инкубируют при 37оС в течение 30 минут.

 

 

i iii) Планшеты промывают три раза раствором для промывания (0.5 мл/литр Твин 20). 

 

 

i iv) Во все лунки добавляют конъюгат белка А/пероксидазы в заранее определенном разведении в ФБР/Твин буфере, рН 7,2 (см. выше) с добавлением фракции V альбумина бычьей сыворотки (10 г/литр). Планшеты инкубируют при 37оС в течение 30 минут.

 

 

i v) Планшеты промывают три раза раствором для промывания (0.5 мл/литр Твин 20). 

 

 

i vi) На каждый планшет наносят соответствующую смесь хромагена/субстрата, такую как тетраметил бензидин (ТМБ)/перекись водорода.

 

 

i vii) Остановку реакции производят с помощью 2М серной кислоты. Показатели абсорбции считывают при 492 нм.

 

 

Тест должен пройти полную валидацию с использованием известных положительной и отрицательной сывороток и калибровку по отношению к международной стандартной эталонной сыворотке крови МЭБ. Во все тесты должны быть включены положительные и отрицательные внутренние контроли, включая слабоположительный контроль, который при разведении до соответствующего для теста уровня разведения имеет актив