Выполнения испытания, оценка результатов. (ttps://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0002-15-mikrobiologicheskaya-chistota/)

используются методы для определения микробиологической чистоты в нестерильных лекарственных средствах (НЛС), в том числе в лекарственных средствах (ЛС), содержащих живые микроорганизмы, а также вспомогательные вещества и полупродукты,также используются при определении эффективности антимикробных консервантов и мониторинге производственных помещений фармацевтических предприятий и отдельных лабораторий.

НЛС (субстанции, различные формы препаратов – таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии, сиропы, мази, суппозитории и др., а также вспомогательные вещества) могут быть контаминированы микроорганизмами. В НЛС допускается лимитированное количество микроорганизмов при отсутствии определенных видов, представляющих опасность для здоровья человека.презентация <- ссылка

Метод мембранной фильтрации Подсчет колоний производят через 48 – 72 ч (предварительные результаты) и через 5 сут (окончательные результаты). Отбирают чашки, в которых число колоний бактерий на фильтрах не превышает 100, а грибов – 50, и рассчитывают число микроорганизмов на 1,0 г (1,0 мл) образца или на 1 пластырь. Если на фильтре большее количество микроорганизмов, то делают ряд последовательных разведений образца и выбирают подходящее.

Метод наиболее вероятных числев (НВЧ) Отмечают число пробирок в первом, втором и третьем рядах, в которых визуально наблюдают рост микроорганизмов. Среда в пробирках четвертого ряда (контроль разбавителя) должна оставаться стерильной. Полученное трехзначное число соответствует наиболее вероятному количеству жизнеспособных микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл лекарственного средства. нвч смотрят по таблице в фс.

Определение антимикробного действия После окончания времени инкубации просматривают посевы и отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках (без препарата) и испытуемых (с различными разведениями препарата).

       В случаях, затрудняющих учет результатов (помутнение или изменение окраски жидкой среды в результате взаимодействия ЛС с питательной средой), делают пересевы на агаризованные среды.

      При наличии роста E. coli, S. abony, P. aeruginosa, S. аureu s на питательных средах делают вывод об отсутствии антимикробного действия исследуемого препарата.

 

Наличие в испытуемых чашках и пробирках роста тест-микроорганизмов, аналогичного контрольным, обозначают знаком «+», отсутствие роста – знаком «–». Если на средах с препаратом наблюдают уменьшение количества колоний на чашках или отсутствие роста тест-микроорганизмов, делают заключение о наличии у него антимикробного действия.

Первое из последовательных разведений препарата, в котором отсутствует антимикробное действие, используют для посева на соответствующую питательную среду.

 

 

16. Сравнительная характеристика испытаний на пирогенность и бактериальные эндотоксины.

Испытанию на пирогенность и БЭ (бактериальные эндотоксины) проводятся в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения и фармацевтических субстанциях, используемых для их изготовления.

 

Испытание на пирогенность основано на измерении температуры тела у кроликов до и после инъекции. Испытание на содержание бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив). ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными

эндотоксинами. В результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина.

 

Существуют три основных методологических подхода для проведения данного испытания:

- гель-тромб метод, основанный на образовании геля;

- турбидиметрический метод, основанный на помутнении реакционной смеси после расщепления субстрата, содержащегося в ЛАЛ-реактиве;

- хромогенный метод, основанный на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид-хромогенного комплекса.

 

Тест на пирогенность проводя т на группе из трех кроликов с исходной температурой 38,5-39,5 ºС.Можно проводить поэтапно. На каждом этапе используют трех кроликов. Максимальное число этапов не больше четырех.

По окончании каждого из этапов испытания определяют максимальное изменение температуры (t) тела каждого кролика по сравнению с исходным значением. Изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нулевое и не учитывают.

(Для трех кроликов определяют сумму индивидуальных максимальных повышений температур (t). Значения t, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, а результаты сравнивают с уровнями, указанными в Таблице в ОФС.)

 

Лекарственное средство признают пирогенным, если результат на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины, указанные в таблице, а также в том случае, если в результате четырех этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5ºС более, чем у трех кроликов из двенадцати. 

Лекарственное средство считают выдержавшим испытание на БЭ, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье.

 

 

(В испытании на пирогенность посуда для разведения, шприцы и иглы для инъекций должны быть стерильными и апирогенными, что обеспечивается нагреванием при температуре 250ºС в течение 30 минут или 200ºС в течение 60 минут.

В испытании на БЭ стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, для этого нагревают при температуре 250 °С не менее 30 минут.)

 

Статьи ГФ:

http://pharmacopoeia.ru/wp-content/uploads/2016/09/OFS.1.2.4.0006.15-Bakterialnye-endotoksiny.pdf

http://pharmacopoeia.ru/wp-content/uploads/2016/09/OFS.1.2.4.0005.15-Pirogennost.pdf