Глава 12. Стратегия проведения микроинъекций

 

При определении стратегии для проведения микроинъекции в живую клетку необходимо ставить перед собой ряд вопросов, выяснение которых должно способствовать осуществлению цели и задачи эксперимента: что и как вводить в клетку, куда, какое количество вещества, в каком виде, когда (в какой период жизнедеятельности клетки), и, наконец, зачем проводить то или иное введение. Решение последнего вопроса определяет предполагаемый результат исследования.

 

12.1. Что можно вводить в клетку?

 

Можно вводить простые молекулы, красители или маркеры, сложные вещества в растворах различной концентрации, а именно: соли, белки, ДНК, РНК и др., а также хромосомы, митохондрии, ядра клеток, цитоплазму (взятую из другой клетки). Учитывая, что эти вещества, как правило, являются чужеродными для клетки, следует не только учитывать возможные реакции клеток на них, но и наблюдать судьбу этих веществ, начиная с момента введения их в клетку.

 

12.2. В каком виде (в какой форме) вводить вещества и органллы в клетку

 

В каком виде (в какой форме) вводить вещества и органеллы в клетку решается в каждом конкретном случае. Следует четко отдавать отчет, например, в какой форме находятся молекулы ДНК — в компактизованной, в виде фрагментов, спирализованной, суперскрученной форме или в виде плазмид, так как экспрессия разных форм происходит по-разному. При пересадке ядер важно инъецировать их в окружении хотя бы тонкого слоя цитоплазмы, так как без такого слоя (контрастно наблюдаемого в фазовом контрасте и при микропипетках, имеющих небольшой диаметр), как правило, не происходит встраивания ядер в клетки донора.

12.3. Как много (сколько) вводить в отдельную клетку материала?

 

Что касается введения молекул ДНК, то известно, что для экспрессии достаточно инъецировать в ядро клетки всего лишь 5-10 молекул и, наоборот, слишком большое количество молекул ДНК не приводит к желаемым результатам. В вопросе о количестве введения различных красителей в клетку также существуют разумные пределы, которые необходимо определять практически. При пересадке ядер самое сложное освободить переносимое ядро от сопутствующих чрезмерных объемов растворов и цитоплазмы, которые наносят повреждения в клетке-доноре, ее внутренней архитектонике.

 

12.4. Как инъецировать?

 

Вопрос: как инъецировать? прежде всего связан с тем, что скорость выхода инъецируемого материала из инъектора может разрушить не только сам материал при выходе из микропипетки, но и внутриклеточные органеллы. Существует, как мы отмечали, более четырех десятков методов введения вещества в клетку. Отдавая предпочтение достоинствам метода микроинъекции под давлением, следует указать, что для этого метода можно найти большое разнообразие способов введения, используя различные способы подачи давления в микропипетку. Можно апплицировать вещества на поверхность клетки или на поверхность внутриклеточных органелл. Вещество можно ввести локально объемом раствора (в виде капли) или сильной струей (треком), или диффузно, привлекая к микроинъекции под давлением микрофорез. В каждом отдельном случае реакция клетки будет различной. Например, при введении ДНК могут быть различные способы прокалывания микропипеткой цитоплазматической мембраны (при помощи пьезоудара, вибрации микропипетки или при резком введении вещества в клетку) или проникновения кончика ее внутрь ядра. При этом могут наблюдаться совершенно различные реакции клетки и различная судьба инъецируемого материала в клетке. Определить оптимальный способ введения вещества, разумеется, можно только практически.

 

12.5. Куда инъецировать?

 

Для клетки небезразлично место укола, так как клетка имеет полярность, она билатеральна, и место инъекции часто зависит от цели и задач эксперимента. Но, тем не менее, следует предостеречь от очевидных ошибок, а именно, если клетка находится в активном состоянии, всякое введение микропипетки определяется ею как введение инородного тела, которое она сейчас же пытается отторгнуть образованием вокруг погруженного в цитоплазму участка микропипетки мембраны, и как бы выталкивает его наружу из цитоплазмы. При этом, с одной стороны, инъецируемый материал может накапливаться между вновь образованной мембраной и конусом кончика микропипетки, с другой, струя (трек) выходящего из кончика микропипетки раствора может прорвать мембрану и только частично попасть внутрь клетки. В связи с этим достаточно трудно количественно определить влияние инъецируемого материала. Локальное введение веществ (или органелл) в клетку должно определяться целью микроинъекции. Например, при исследовании транспорта различных молекул из цитоплазмы в ядро и наоборот выбирают конкретно определенные точки введения (в автоматизированных системах микроинъекции это определяется при помощи компьютера на экране дисплея) и тем или иным методом определяют отдельные параметры перемещения введенных молекул внутри клетки.

При инъекциях в пронуклеусы ооцитов или зигот важным оказывается определить место прокола наружной цитоплазматической мембраны, так как есть места, прокол которых может привести в дальнейшем к аномальному развитию эмбриона.

 

12.6. Когда инъецировать?

 

Это весьма важный вопрос, решение которого определяется задачами эксперимента. В зависимости от вида, линий, штаммов клеток он решается неоднозначно. Ранние эмбрионы до и после оплодотворения по-разному реагируют на процесс проникновения в них микроинструментов. При пересадке ядер, например, время с момента оплодотворения до первого деления может быть разделено по вязкостно-механическим параметрам на несколько основных периодов: время резкого снижения вязкости цитоплазмы и, соответственно, упругости клетки в целом, время состояния цитоплазмы с пониженной вязкостью и пониженными упругими свойствами клетки и время относительно быстрого повышения вязкости до момента дробления ядра. В эти периоды оптимальная работа с такой клеткой полностью зависит от задач, поставленных экспериментом. В случае, например, необходимости пересадки ядер наиболее благоприятным следует считать последний период, непосредственно перед делением ядра клетки-донора. Для выбора момента микроинъекции следует также определять оптимальный период состояния клеток. Для клеток в культуре, например, важным является определение момента введения в них различных веществ в зависимости от стадии развития, то есть от фаз развития: G₁, S, G₂ и M. Это также должно корректно определяться в каждом конкретном случае и в зависимости от поставленных задач.

 

12.7. Зачем инъецировать?

 

Этот вопрос постоянно контролирует каждый этап эксперимента, каждое действие экспериментатора. И чем чаще он задается, тем меньше будет необъяснимых факторов. В идеальном случае оператор и экспериментатор должен являться одним лицом, так как микроинъекция как элементарная микрохирургическая операция со всеми своими тонкостями полностью определяет результат решения поставленной задачи.

Однако не следует слишком усложнять ситуацию. Серийные микроинъекции и внимательный анализ каждого эксперимента могут подсказать оптимальные решения методики инъекции и сделать правильный вывод для каждого эксперимента. Если вопрос касается практической стороны микроинъекции, то почти всегда имеется реальная возможность изменить ход событий при инъекции в необходимом направлении. При анализе результатов эксперимента следует учитывать различные механизмы взаимодействия инъецируемого материала с отдельными компонентами клеток на структурном и молекулярном уровнях и искать альтернативные методы введения веществ в клетку.

 

 

Приложение

 

Приложение 1. Форма протокола условий эксперимента

(Проведение микроинъекций веществ в клетку)

 

При ведении протокола микроинъекции вопрос «зачем» можно вынести в графу «Примечания» для каждого этапа эксперимента (см. таблицу):