Группа: Трансфекция вирусами, сперматозоидами, молекулярными конструкциями

1. Проникновение в клетки различных вирусов, несущих инъецируемые комплексы

2. Перенос сегментированной чужеродной ДНК при помощи сперматозоидов после их совместной инкубации

3. Проникновение в клетки вирусных частиц, собранных in vitro

4. Перенос генов при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза (реоэндогенез)

5. Трансфекция клеток агробактериями

6. Использование моноклональных антител в качестве векторов для переноса веществ в клетку

Последняя группа методов микроинъекций — трансфекция при помощи вирусов как векторных систем весьма интенсивно развивается в настоящее время, и мы ее отнесли в отдельный раздел, представленный прекрасным обзором практически всех работ по этой теме. Этот обзор можно найти в Интернете http://www.epub.org.br/bjmbr/year1999/v32n2/3353c.htm или в статье Дани (Dani S., 1999).

 

Глава 2. Физические методы введения веществ в клетку

 

2.1. Микроэлектрофорез

 

Микроэлектрофорез – как направленное перемещение дисперсной фазы через микропипетки под действием разности электрических потенциалов — может с успехом использоваться для микроинъекции веществ, генетического материала или органелл в клетку. В виде дисперсной фазы здесь могут быть как органеллы, молекулярные комплексы и макромолекулы, имеющие заряд, так и отдельные ионы. Следует сразу отметить, что микроэлектрофорез через стеклянные микропипетки включает в себя электроосмос. При электроосмосе наблюдается направленное перемещение жидкости под действием приложенной разности потенциалов, причем его интенсивность зависит и от диаметра кончика микропипетки.

На рисунке 1 представлена схема микроинъекции с одной микропипеткой и индифферентным электродом и с двумя микропипетками, в одной из которых находится индифферентный электрод. Индифферентный электрод (иногда называемый “электродом ванночки”), как видно из рисунка, может находиться вне клетки или внутри нее. Потенциал индифферентного электрода всегда должен быть близок к нулю или равен нулю.

 

Рис. 1. Микроэлектрофорез единичной клетки:        А — микроэлектрофорез с использованием одной микропипетки        Б — микроэлектрофорез с использованием двух микропипеток

 

 

Достоинства метода

а) Введение малых объемов раствора в локальные участки клетки и внутриклеточные органеллы;

б) Возможность регулировать концентрации инъецируемых растворов вещества, изменяя время микроэлектрофореза;

в) Относительно точное регулирование медленного введения раствора из микропипетки в клетку;

г) Отсутствие травматического воздействия струи инъецируемого раствора вследствие медленного введения определенного его объема;

д) С помощью сдерживающего тока есть возможность борьбы со спонтанной утечкой веществ из микропипетки в клетку или окружающую среду;

е) Гибкие шланги и сочленения не вносят вклад в погрешности инъекции;

ж) Удобство количественной оценки инъецируемого вещества по току микроэлектрофореза (если количество вводимого вещества заранее прокалибровано по времени);

з) Селективное введение веществ, имеющих определенный заряд;

и) Возможность производить микроинъекцию через кончик тонких микропипеток диаметром 0,1 — 0,5 мкм и менее.

К недостаткам метода следует отнести следующие:

а) микрофорез представляет собой сложный процесс — особенно ионофорез, в котором присутствует диффузия как объемный поток, обусловленный градиентом гидростатического давления, и как объемный поток, обусловленный электроосмосом. Разделить их очень сложно;

б) процесс инъецирования вещества может быть очень длительным;

в) не позволяет использовать значительные количества клеток;

г) затруднена точная оценка инъецируемых объемов вещества;

д) при использовании больших токов неизбежно повышается температура среды;

е) в отдельных случаях при этом может происходить гибель клеток;

ж) загрязнение или кристаллизация в области кончика микропипетки приводит к возникновению своего рода полупроницаемой мембраны, через которую проходят мелкие ионы типа ОН^- или Cl^-, но не могут проникать большие ионы типа глутамата;

з) часто невозможно освободиться от загрязнения, попавшего в кончик микропипетки. Такую микропипетку, как правило, в дальнейшем не используют;

и) количество инъецируемого вещества зависит от его электрохимических свойств;

к) нельзя инъецировать вещество, имеющее нулевой суммарный заряд и малый коэффициент диффузии;

л) практически сложно инъецировать органеллы и фрагменты клеток;

и) при инъецировании вещества из клетки выходят ионы противоположных зарядов;

н) при использовании импульсного тока большой амплитуды клетки могут повреждаться в процессе инъекции. На практике существует способ прокалывания («прожигания») мембраны током.

 

2.2. Микроинъекция уколом микроиглы

Это собственно микроинъекция, при которой с помощью стеклянной тонкой микроиглы прокалывают цитоплазматическую мембрану клетки, находящейся в окружении инъецируемого раствора. За счет адсорбции на поверхности микроиглы вещество раствора переносится частично, точнее, в следовых количествах внутрь клетки или даже в ядро. Этот метод предложили японские исследователи и использовали его для инъецирования ДНК в прикрепленную культуру клеток, растущих в чашках Петри (Furusava et al., № Patent, 4,270,838, 1981).

 

Рис. 2. Микроинъекция уколом микроиглы: А — микроигла находится в растворе и адсорбирует молекулы ДНК Б — при уколе в клетке остаются молекулы ДНК

 

 

Микроигла может совершать очень быстрые уколы и тем самым определяются чрезвычайно высокие скорости всего процесса микроинъекции — до 4000 уколов в час (Yamamoto et al.,1982). О преимуществах и недостатках этого метода можно только предполагать, так как ни в литературе они не обсуждаются, ни собственного опыта мы не имеем. Основным достоинством этого метода, по видимому, является относительная его простота. Однако ограниченное, почти следовое количество вещества, поступающее в клетку даже при множественных уколах, невозможность количественных определений вводимого вещества и длительное пребывание исследуемой клетки в среде, влияние которой изучается при инъекциях, вряд ли могут обеспечить широкое использование этого метода в эксперименте.

 

 2.3. Микроинъекция в сочетании с микроэлектрофорезом

 

Микроинъекция в сочетании с микроэлектрофорезом интересна тем, что, кроме микропипетки с инъецируемым раствором, в ядро клетки вводят микроэлектрод, и молекулы ДНК поступают в него при помощи электрического тока (Крастс, 1975).

Одним из преимуществ такого метода является введение значительно большего числа молекул в ядро клетки в сравнении с другими методами. Кроме того, в ядро попадают, в основном, только молекулы, имеющие заряд, а, поскольку в клетку не вводится значительный объем жидкости, существенно уменьшаются механические повреждения. Авторы отмечают, что нет локального скопления молекул ДНК, они свободно распределяются по клетке под действием электрического поля. Следует заметить при этом, что взаимодействие ДНК с клеткой идет по принципиально иному пути, имеет иной характер встраивания чужеродной ДНК в геном (Глебов, 1989).

К недостаткам такого метода можно отнести относительную травматичность клеток, так как в клетку вводят практически одновременно два микроинструмента. Этот метод требует особой осторожности работы с клеткой и высокого профессионализма оператора.

В общих чертах можно полагать, что этот метод имеет почти те же достоинства и недостатки, что и микроэлектрофорез без введения дополнительного микроэлектрода внутрь клетки.

 

 2.4. Метод высокоскоростного механического пробоя

Метод высокоскоростного механического пробоя заключается в отстреле микрошариками из вольфрама с нанесенным на их поверхность раствором ДНК культуры клеток, растущих на чашках Петри (Klein, et al., 1987). Преципитацию ДНК на вольфрамовую поверхность осуществляют с помощью хлористого кальция и спермидина или Ca-фосфатным методом, используя 10 мг частиц на 1 мг раствора. Микрошарики из вольфрама (диаметр 0.1 — 1.0 мкм) помещают на передней поверхности «пули», которую в свою очередь заряжали в специальную «пушку». Используются стандартные пистоны. После этого производили выстрел так, чтобы пуля получила начальную скорость около 450 м/с, а микрошарики равномерно разлетелись по поверхности чашки Петри с клетками.

 

Рис.3. Метод высокоскоростного механического пробоя

 

 

Микрошарики, пробивая клетки насквозь, через цитоплазму или ядро, оставляют в них молекулы ДНК.

2.5. Высокоскоростной механический ДНК-пробой

Высокоскоростной механический ДНК-пробой не превышает по эффективности Ca-фосфатный метод. Однако авторы (Zelenin et al., 1989) отмечают весьма существенные преимущества этого метода, а именно: вводимая в клетки ДНК сразу попадает в ядро, возможна генетическая трансформация для клеток, которые трудно или невозможно трансформировать с помощью других методов; возможность введения ДНК в многоклеточные культуры, ткани, эксплантированные из организма (например, асцитная форма клеток тератокарциномы), а также клеткам, находящимся в составе целого организма, например, через эпителиальный покров млекопитающих.

Этот метод, по-видимому, может иметь будущее, так как, меняя, например, скорость микрошариков-носителей и способ их отстрела, можно производить «трековое» введение веществ в клетки с известной степенью точности попадания в отдельные участки клеток или целые объемные области тканей и органов, расположенные на различной глубине.

 

2.6. Спонтанная микроинъекция за счет временного образования пор в мембране клетки (лазером, электрическим пробоем)

 

К методам, находящимся скорее в промежуточном положении между собственно микроинъекцией под давлением и методами, способствующими образованию пор в мембране для инъекции, то есть введения веществ в цитоплазму или ядро клетки, относятся методы, использующие лазерные лучи и электрический пробой клеточных мембран (Karate et al., 1986). Импульсный световой пучок лазера или электрический пробой инициирует кратковременное образование небольших пор в мембране, начиная с цитоплазматической и затрагивая внутриклеточные мембраны. За это время через поры могут проходить в клетку вещества из среды, в которой клетки находятся. Механизм прохождения молекул через поры при использовании этих методов различен и пока полностью не ясен, но вряд ли только образование пор способствует проникновению веществ через мембрану.

Рис. 4. Облучение клеток лазерным лучом для образования пор в мембране: А — ДНК находится в питательной среде над клетками Б — образование пор в мембране клеток с помощью электрического разряда

 

 

В некоторых работах показано использование лазера для генетической трансформации соматических клеток (Karate et al., 1986). Режим работы лазера импульсный: облучение клеток в течение 5 нс при длине волны 350 нм. Эффективность «лазерной» трансформации на два порядка выше эффективности Са-фосфатного метода. Однако скорость обработки клеток лучом лазера может составлять 10³ клеток в час.

О достоинствах этих методов нам пока трудно судить, но ясно, что образование, хотя и кратковременное, пор, по-видимому, связано с поглощением достаточно большой энергии и существенно при этом иметь правильное представление о состоянии клеточных структур в этот момент в области пор. Методы эти дорогостоящие и требуют специальной аппаратуры и другого оборудования. Тем не менее в настоящее время этот способ достаточно широко применяется.

 

 2.7. Осмотический шок

 

Осмотический шок — гипертонический солевой метод переноса молекул ДНК в клетки животных. В растворе NaCl (0.5 — 1.0 M) в присутствии очищенной ДНК вируса полиомы происходит инфицирование культуры клеток (Di Mayorca et al., 1959). Предполагается, что в цитоплазматической мембране возникает осмотический разрыв, через который проникает ДНК.

 

Рис. 5. Осмотический шок: А — сжатие клеток в гипертоническом растворе Б — набухание клеток в изотоническом растворе в присутствии ДНК

 

 

Недостаток этого метода — пребывание клеток в гипертоническом растворе со всеми связанными для нее последствиями, то есть, в первую очередь, значительной утечкой внутренней воды и даже некоторых внутриклеточных растворенных компонентов. При этом следует учитывать, например, что полное восстановление синтеза белка клеток после осмотического шока происходит через 20 — 25 часов.

 

 2.8. Обработка ультразвуком

 

Введение веществ после обработки клеток ультразвуком обуславливается, по-видимому, проницаемостью мембраны и временным образованием в ней пор в поле кавитации. Однако эффективность трансфекции при обработке ультразвуком невысока.

 

Рис. 6. Обработка клеток ультразвуком: А — «озвучивание» клеток в чашке Петри с целью образования пор в мембране Б — проникновение ДНК в клетку через поры клеточной мембраны

 

 

Недостатком этого метода является воздействие ультразвука на всю клетку, чувствительность к которому хорошо известна.

 

2.9. Метод соскабливания клеток с субстрата

 

Метод соскабливания клеток с субстрата в присутствии экзогенной ДНК скорее препаративный метод, хотя и обладает высокой эффективностью (временная трансфекция может достигать 80% на пятый день после соскабливания) (Teccheimer et al. 1987). В качестве субстрата служит чашка Петри или покровные стекла, на которых распластаны клетки. Метод основан на отрыве клеток с субстрата при помощи резинового скребка. В местах прикрепления клеток к субстрату образуются при этом разрывы, через которые проникают молекулы ДНК, присутствующие в растворе. Эффективность этого метода, по-видимому, зависит от степени связывания клеток с субстратом и искусства механического снятия их с субстрата.

 

Рис. 7. Метод соскабливания клеток с субстрата в присутствии экзогенной ДНК