Глава 11. Трудности, возникающие при работе с микрообъектами

 

11.1. Пути их преодоления

 

Главная трудность метода микроинъекции состоит в том, что одна, даже незначительная ошибка, может повлечь за собой ряд систематических, не учитываемых погрешностей дозирования инъецируемых в клетку растворов. Раньше мы охарактеризовали особенности отдельных этапов этого процесса. Суммируя все сказанное, рассмотрим самые уязвимые места микроинъектора (на примере шприцевого), в которых наиболее часто встречаются на практике ошибки. На рисунке показаны эти места цифрами. Краткие рекомендации помогут избежать самых распространенных ошибок.

 

11.2. Кончик микропипетки

 

1. Если в кончик микропипетки попала любая взвешенная частица-пылинка, сгусток белка, мембраны или часть органеллы, инъекцию или вообще невозможно произвести, или инъецируемые объемы до и после засорения будут неконтролируемыми в зависимости от того, будет ли закупорка полной или частичной; возможность засорения просвета микропипетки зависит также от того, заточен или не заточен ее кончик.

2. Раствор перед инъекцией следует обязательно отцентрифугировать.

3. Калибровку скорости истечения инъецируемых растворов, обладающих различной вязкостью, следует производить отдельно для каждого раствора.

4. Следует избегать применения слишком вязких растворов для инъецирования через тонкие кончики микропипеток, что особенно важно для серийных микроинъекций.

5. Недопустимо образование воздушных пузырьков в кончике микропипетки и в ее конусной части.

6. Длинные и тонкие кончики микропипетки требуют более высоких давлений.

 

11.3. Конусное сужение микропипетки

 

1. Чем больше конусность микропипеток (отношение большого диаметра к меньшему для сечений, находящихся на одинаковом расстоянии друг от друга), тем больше дополнительное сопротивление (отражение).

2. Большие воздушные пузырьки в конусной части микропипетки не позволяют производить отсчеты инъецируемых доз в процессе микроинъекции.

 

11.4. Соединение микропипетки с держателем микропипетки

 

1. Для обеспечения герметичности в месте соединения микропипетки с ее держателем диаметр ствола микропипетки и внутреннее отверстие зажимной гайки не должны сильно отличаться друг от друга, а уплотнительные резиновые или силиконовые кольца должны быть плотно пригнаны к микропипетке.

2. При зажиме микропипетки не должно быть продольного и поперечного качания ее в держателе, так как с изменением давления в системе микроинъектора возможна деформация уплотнителей и искажение за счет этого показания дозатора.

3. Уплотнительные кольца должны быть выполнены из достаточно упругих материалов, так как слишком мягкие кольца не могут создать жесткого крепления микропипетки в держателе. Вместо колец можно использовать силиконовые трубки с внутренним диаметром, равным наружному диаметру ствола микропипеток. Длина трубки приблизительно 3-5 мм. В держателе эта трубка сильно деформируется и плотно охватывает ствол микропипетки, не давая микропипетке продольно перемещаться даже придостаточно высоких давлениях.

4. Герметичность сочленений и отсутствие утечек через них раствора или воздуха обеспечивает правильную работу микроинъектора.

5. Концы трубки необходимо особенно надежно закреплять на штуцер держателя микропипетки и на шприце. Обычно для этой цели используют дополнительные хомутики или несколько витков мягкой проволоки, обеспечивая дополнительный обжим концов трубки.

6. Материал, из которого изготовлена трубка, не должен сильно деформироваться при изменении давления внутри трубки (желательно использовать толстостенные полиэтиленовые трубки или лучше тефлоновые). Внутренний диаметр трубок следует выбирать небольшой —1-2 мм. Большой внутренний диаметр трубок даже при достаточно толстых стенках может деформироваться при больших давлениях, что, в свою очередь, увеличивает время истечения растворов из микропипетки и может вносить искажения в отсчете инъецируемых доз.

7. В случае использования полного заполнения микроинъекционной системы жидкостью недопустимы воздушные пузырьки в подводящей системе, при этом необходимо быть особенно внимательным при создании в инъекционной системе отрицательного давления (при всасывании растворов цитоплазмы или органелл).

 

11.5. Поршень микроинъектора

 

1. Уплотнение поршня должно быть из твердой силиконовой резины, и его можно улучшить, проложив несколько слоев ниток в паз между поршнем и резиновым кольцом.

2. Не должно быть утечки жидкости, заполняющей шприц, через уплотнительное кольцо поршня и цилиндр шприца.

 

11.6. Пружины шприца

 

Пружина должна быть такой, чтобы без остановки поршня менять направление его движения по всей задействованной длине цилиндра шприца. Длина хода поршня определяется возможностью перемещения микрометрического винта.

 

11.7. Сочленение штока поршня

 

Сочленение штока поршня шприца со штоком микрометрического винта должно быть подвижным, но без люфта.

 

11.8. Другие проблемы при работе с живыми клетками

Для других типов микроинъекторов возможные источники ошибок, естественно, будут другими, и их следует четко определить.

Источником ошибок, помимо непосредственно конструкции микроинъекторов, могут быть паразитные вибрации, нестабильная температура окружающей среды и микроскопического объекта исследования. Кроме перечисленных источников ошибок, можно отметить возможные ошибки, встречающиеся непосредственно при работе с микрообъектом.

При работе с клеткой часто встает ряд, казалось бы, простых задач, при решении которых возникают определенные трудности. Простая на вид задача введения различных веществ в клетку встречает ряд трудностей в технике микроинъекции вязких растворов, небольших калиброванных объемов вводимых жидкостей и многие другие. Одной из таких задач является проникновение микроинструмента в клетку без повреждающей ее деформации, без разрывов, утечки цитоплазмы и пр. Здесь очень многое зависит от правильной заточки кончика микропипетки.

Если клетка из-за упругой и прочной стенки все же подвергается деформации в процессе прокола, то время пребывания ее в таком состоянии при проколе заточенной микропипеткой сокращается до минимума, что, в свою очередь, способствует снижению утечки через всю поверхность клетки внутриклеточной свободной воды и даже низкомолекулярных компонентов.

Заточенный кончик микропипетки не забивается (не закупоривается), так как имеет значительно большее выходное отверстие, чем не заточенная микропипетка, что очень важно при серийных микроинъекциях. Параметр кончиков микропипеток должен иметь оптимальные размеры. В связи с тем, что инъецируемые растворы, как правило, обладают повышенной вязкостью и для того, чтобы сохранить вводимые в клетку макромолекулы в целости — не подвергать их гидродинамическому разрыву (например, линейные молекулы ДНК), диаметр кончиков не должен быть слишком маленьким. С другой стороны, для того, чтобы клетка нормально перенесла перфорацию, диаметр микропипетки не должен быть и слишком большим.

Кончик микропипетки порядка 1 мкм проникает в клетку относительно хорошо и без заточки, если клетка достаточно упруга. Для неупругих клеток и такой диаметр микропипетки является большим. Для облегчения прокола мембраны клетки или ее стенки такие пипетки следует обязательно затачивать или применять специальные метода введения кончика микропипетки в клетку (резкий удар за счет вибрации микропипетки, переменная частота вибрации кончика, увеличение натяжения прокалываемого участка клетки, пъезоударные устройства и др.).

Следует обратить внимание на тот факт (практически не освещенный в литературе), что микропипетка, имеющая тонкий кончик, по-разному реагирует на окружение, а именно — на воздухе, в растворе, при контакте с клеткой и в контакте с цитоплазмой. Это становится особенно важным при использовании многодозового микроинъектора, например, системы «Эппендорф». Рассмотрим этот процесс подробней.

При условии одного и того же подпирающего давления внутри микропипетки (служащего для выравнивания капиллярных сил, расклинивающих сил, сил поверхностного натяжения, смачивания и преодоления сил сопротивления, возникающих при выталкивании жидкости через кончик микропипетки) выход инъецируемой жидкости из пипетки будет зависеть от того, где находится кончик микропипетки. Если кончик находится на воздухе, жидкость практически не выходит из полости микропипетки при оптимальных добавочных давлениях. Правда, возможно выползание полислоев жидкости на наружную поверхность пипетки за счет смачивания, однако для гидрофобизированной пипетки такого явления не наблюдается.

Если кончик пипетки находится в микрокамере или чашке Петри в жидкости, выход раствора из полости микропипетки происходит более интенсивно, и это хорошо видно при наблюдении в люминесцентнм микроскопе. Кончик как будто «дымит». С таким явлением экспериментаторы мирятся, но по сути это вносит в окружающую клетки среду значительные «загрязнения» инъецируемым веществом.

Более сложныЙ и важный процесс наблюдается в момент касания кончиком микропипетки мембраны клетки, когда прокола еще не произошло. В этот момент иногда происходит весьма интенсивный выход инъецируемой жидкости на наружную поверхность мембраны. Происходит как бы апплицирование инъецирующей жидкости на поверхность клетки. Это важный момент для контрольных работ по введению меченых растворов, флюоресцирующих зондов и др.

В момент касания кончика микропипетки наружной поверхности клетки инъецирующая жидкость, касаясь мембраны, растекается по ней, по-видимому, за счет сил смачивания. Это явление наблюдается для гидрофобизированных и негидрофобизированных микропипеток.

В случае, когда кончик микропипетки находится в цитоплазме, выход инъецируемой жидкости за счет все того же «подпирающего» давления будет зависеть как от состояния цитоплазмы, так и свойств самой инъецируемой жидкости. Во всяком случае цитоплазма, будь она в состоянии золя или геля, является для выходящей жидкости специальной средой, которая меняет гидродинамическое сопротивление выходу жидкости из кончика микропипетки. Изменение подпорного (подпирающего) давления внутри полости микропипетки сдвигает картину истечения жидкости в ту или иную сторону и является необходимым, но недостаточным условием для проведения микроинъекции.

Какой вывод напрашивается из всего сказанного? Во-первых, необходимо тщательно подбирать подпорное давление. Не следует подбирать это давление в тот момент, когда кончик микропипетки находится на воздухе, так как при введении микропипетки в жидкость и тем более при контакте кончика с клеткой это давление может оказаться слишком велико. Во-вторых, нельзя удерживать долго кончик микропипетки в контакте с клеткой без прокола. В-третьих, время пребывания кончика микропипетки внутри клетки нужно стараться сократить до минимума. Здесь, правда, лимитирующим фактором может быть скорость истечения через кончик микропипетки, так как при слишком большой скорости могут разрушаться некоторые макромолекулы или органеллы, инъецируемые в клетку или находящиеся в ней.