Микроманипуляционные методы микроинъекции

1. Микроинъекция под давлением через стеклянные микропипетки

2. Прокол клеток микроиглой, проходящей через раствор инъецируемого материала

3. Микроинъекция в сочетании с микроэлектрофорезом

4. Микроэлектрофорез

Биолистические методы

1. Высокоскоростной механический пробой (отстрел микрошариков с молекулами инъецируемого материала на их поверхности

2. Биолистическая трансфекция при помощи частиц золота, на поверхности которых находится инъецируемый материал, ускоренных под действием электрического поля

3. Аэрозольная биолистика

Перфорационные методы

1. Перфорация клеток при встряхивании их в инъецируемом растворе с тонкими силиконовыми волокнами

2. Перфорация клеток острыми кристаллами карбида кремния (в присутствии инъецируемых растворов)

3. Электропорация (электропробой плазматической мембраны)

4. Пробой мембраны лазерным микролучом

5. Обработка ультразвуком

6. Перфорация плазматической мембраны при помощи фильтров

7. Соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенной ДНК

8. Центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией

9. "Осмотическая" перфорация плазматической мембраны

Методы опосредованной микроинъекции

Микроинъекция под действием физических факторов

1. Электрослияние микроклеток-доноров с клетками-реципиентами

2. Термослияние клеток

3. Электроакустическое слияние клеток

4. Слияние клеток после облучения γ-излучения

5. Слияние клеток после облучения их поверхности ИК (инфракрасным) лазером

Микроинъекция с использованием слияния клеток с клетками-донорами

1. Введение нуклеиновых кислот при помощи "теней" эритроцитов

2. Введение нуклеиновых кислот при помощи липосом (липосомный перенос)

3. Включение в клетки изолированных ядер и метафазных хромосом при помощи микроклеток

4. Включение в клетки бактериальных протопластов

5. Перенос генов с изолированными хромосомами

6. Слияние клеток при помощи инактивированного вируса Сендай

Микроинъекция под действием химических агентов

1.Метод копреципитации:

Ca-фосфатный

Rb- фосфатный

Sr - фосфатный

2.Метод Тэн-Окаямы

3.ДЭАЭ-декстраноый метод

4.Использование основных белков (белок-ДНК комплексы)

5.Метод с использованием полибрена (поликатиона)

6.Спонтанное поглощение нуклеиновых кислот в присутствии криопротекторов и многоатомных спиртов

Перенос генетического материала при помощи вирусов, спермиев и молекулярных конструкций

1. Проникновение в клетки рекомбинантных вирусов, несущих инъецируемые комплексы

2. Проникновение в клетки вирусных частиц, собранных in vitro

3. Перенос сегментированной чужеродной ДНК при помощи сперматозоидов, после их совместной инкубации

4. Перенос генов при помощи рецептор-опосредованного эндоцитоза

5. Трансформация клеток агробактериями

6. Использование моноклональных антител в качестве векторов для переноса веществ в клетку

В. Предмет практикума по микроинъекции

Краткий обзор возможностей метода микроинъекции под давлением: Достоинства и ограничение возможностей метода микроинъекции под давлением.

 

Автор Программы Практикума

В.А.Никитин

 

 

«Микроинъекция представляет собой один из экспериментальных методов, который нашел широкое применение только в последние 10 — 20 лет, и поэтому мы пока еще не располагаем сколько-нибудь подробным анализом как преимуществ, так и недостатков этого метода. Однако несомненно, что значение микроманипуляций и особенно микроинъекций, будет все более возрастать при изучении процессов регулирования в живых клетках».

Дж. Гердон «Регуляция функции генов в развитии животных», «Мир», М., 1977.

 

 

Введение

 

Изучение и совершенствование одного из самых распространенных методов микроинъекции под давлением через стеклянные капилляры веществ и отдельных органелл в клетку имеет большое значение для решения различных теоретических, экспериментальных задач и многих прикладных вопросов молекулярной и клеточной биологии. Являясь элементарной операцией над клеткой, микроинъекция открывает широкие возможности исследования процессов регуляции в живой клетке. В генетике и биологии развития животных и растений методы микроинъекций применяют для изучения влияния генов на наследственность, получения клонов, исследования вопросов дифференцировки и развития клеток и тканей, проведения тонких операций на клетках. В генной и клеточной инженерии микроинъекция применяется для реконструкции клеток и при изучении экспрессии рекомбинантных молекул ДНК, открывающих широкие возможности получения трансгенных организмов с измененными генетическими признаками. В биофизике и физиологии этот метод используется для исследования транспортных процессов и влияния разнообразных биологически активных веществ на физико-химические процессы, протекающие в клетке. Микроинъецирование веществ в клетку или ткани широко используются при цитологических и морфологических исследованиях.

В настоящее время различают более четырех десятков методов введения веществ в клетку: микроинъекция через стеклянные микрокапилляры под давлением или с использованием микроэлектрофореза, микроинъекция веществ при помощи слияния клетки с мембранными конструкциями («тени» эритроцитов, мембранные везикулы, липосомы), внутри которых находится инъецируемое вещество и др. (cм. Гл.1).

Во всех случаях эти приемы не всегда просты и требуют всестороннего продумывания логики и техники эксперимента.

Так, методы слияния, практически все, дают возможность производить микроинъекцию только в цитоплазму. При этом в результате слияния в состав клетки-реципиента войдут мембраны эритроцитов или липосомные оболочки.

Перенос генов с помощью молекулярных конструкций связан с учетом дальнейшей судьбы этих конструкций в клетке.

Для прямой доставки веществ или органелл в клетку из всех методов микроинъекция под давлением через стеклянные микропипетки чаще всего используется на практике. Микроинъекция осуществляется введением через тонкие стеклянные микропипетки в различные внутриклеточные органеллы или локально в отдельные участки цитоплазмы клетки минимальных доз растворов вещества, а также отдельных органелл, взятых из других клеток, — ядер, хромосом, митохондрий и других субклеточных компонентов. Процесс введения производится под действием гидравлического или пневматического давления с использованием микроманипуляционной техники.

Метод микроинъекций под давлением является наиболее эффективным, прямым способом введения веществ или органелл в клетку. Однако этот достаточно простой способ имеет для начинающих работать с ним некоторые технические трудности в точной количественной оценке вводимых веществ, требует особой тщательности при подготовке аппаратуры и при непосредственном проведении прецизионных микроинъекций.