Классификация методов микроинъекции:

Программа Практикума

МИКРОИНЪЕКЦИЯ

                         

 

           Автор Программы:

        Ст.н.сотр. В.А.Никитин

 

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

 

"Микроинъекция представляет собой один из экспериментальных методов, который нашел широкое применение только в последние 10-20 лет, и поэтому мы пока еще не располагаем сколько-нибудь подробным анализом как преимуществ, так и недостатков этого метода. Однако несомненно, что значение микроманипуляций и особенно микроинъекций, будет все более возрастать при изучении процессов регулирования в живых клетках". (Дж. Гердон, Регуляция функции генов в развитии животных, Мир, М., 1977).

Интенсивное развитие молекулярной и клеточной инженерии, методов биофизики клетки, клеточной биотехнологии и фундаментальной клеточной биологии выдвигает весьма важную проблему о работе непосредственно с отдельной клеткой. Что может дать такой подход? Прежде всего возможность решать такие задачи, как манипуляция с внутриклеточными структурными элементами, проведение тонких операций с ними, введение в клетку чужеродных веществ, генного материала, изоляция или трансплантация органелл с целью реконструкции клетки, получение чистого клона генетически идентичных клеток или организмов, а также получение трансгенных животных или растений. Такие работы у нас в стране и за рубежом достаточно широко применяются не только в лабораториях исследовательских институтов и университетов, но в медицинской практике, сельском хозяйстве и промышленной биотехнологии. В связи с охраной животного и растительного мира, редких и исчезающих видов животных и растений в исследовательской практике нашел применение термин "клетка - как альтернативный объект исследования", или так называемые "альтернативные" методы проведения экспериментов на единичных клетках без использования лабораторных животных. Клетка растений или животных рассматривается в настоящее время как: «биореактор», «пробирка» для биохимиков, объект для скрининга лекарственных препаратов, генетический источник для клонирования организмов, полигон для трансгенных исследований, объект получения отдельных органов для трансплантации и пр. Именно поэтому внимание к клетке как объекту исследования будет возрастать. Соответственно уже сегодня необходимо закладывать и развивать основы техники и эксперимента с отдельной клеткой.

Микроинъекция нами рассматривается как достаточно сложная операция над клеткой, подготовка клетки к микроинъекции, от того, как вводится микропипетка в клетку, от того, как производится введение вещества в клетку и, наконец, как выводится микропипетка из клетки и как обеспечивается ее дальнейшее культивирование, от этих основных элементов микрохирургии клетки (или другой термин, принятый в литературе - микрургии клетки) и метода микроинъекции в клетку зависит успех эксперимента.

 Цель практикума: знакомство с классическими и новейшими методами микроинъекций веществ и органелл в клетки млекопитающих и растений, с широкими возможностями применения и/или изготовления микроинструментария, работа с биологическим материалом под микроскопом, постановка задачи эксперимента и выбор необходимой техники.

Задача практикума: овладение методами работы с микроманипуляторами, микрокузницей, работа со стеклом, самостоятельное изготовление микроинструментов, обучение отдельным приемам микрохирургии клетки и ранних эмбрионов, овладение методами микроинъекции различных веществ (красителей, генетического материала и отдельных органелл).

Практикум предназначен для студентов по специальностям: биофизика, молекулярная биология, генетика, эмбриология, биотехнология, микробиология.

 

 

ПРОГРАММА ПРАКТИКУМА

 

А. Введение. Области применения микроинъекции под давлением. (некоторые примеры применения микроинъекции в биологических науках). Задачи, решаемые при помощи метода

микроинъекции. Молекулярная биология: Введение чужеродных генов в клетку, микроинъекция как метод для исследования трансформации и экспрессии генов, изучение рекомбинантных ДНК. Генная и клеточная инженерия: Реконструкция генов, введение генов и отдельных их компонентов в клетки, исследования по генетике популяций. Молекулярная и клеточная иммунология: Введение моноклональных антител в клетку, микроинъекция как составной элемент иммунологических методов исследования (введение генов в клетки, работа с гибридомами). Биофизика: для исследования природы изменения проницаемости клеточных мембран, для изменения концентрационных градиентов ионов при изучении постсинаптических потенциалов. Микробиология: Исследование по генетике микроорганизмов, получение чистых культур, клонирование микроорганизмов. Биохимия: Микроинъекция дает возможность работать с клеткой, как с "пробиркой" для исследования различных биохимических реакций. Микрохимия: Отбор и микроманипулирование микродозами биологического материала, отделение компонентов клетки для микроанализов, испытание различных веществ, микрохимический анализ - качественный и количественный. Генетика: Перенос чужеродных генов в геном животных для исследования механизмов мутагенеза и проблем нестабильных генов. Биология развития: Пересадка ядер, хромосом и других органелл с целью реконструкции клеток, исследования ядерно-цитоплазматических взаимодействий в развитии клетки. Физиология и морфология: Применение внутриклеточных инъекций в нейрофизиологии, введение красителей, в том числе и красителей группы люцифера желтого, введение радиоактивно меченных веществ.

 

Б. Современные достижения в области введения веществ и органелл в клетку

Методы прямой микроинъекции

Биолистические методы

1. Высокоскоростной механический пробой (отстрел микрошариков с молекулами инъецируемого материала на их поверхности

2. Биолистическая трансфекция при помощи частиц золота, на поверхности которых находится инъецируемый материал, ускоренных под действием электрического поля

3. Аэрозольная биолистика

Перфорационные методы

1. Перфорация клеток при встряхивании их в инъецируемом растворе с тонкими силиконовыми волокнами

2. Перфорация клеток острыми кристаллами карбида кремния (в присутствии инъецируемых растворов)

3. Электропорация (электропробой плазматической мембраны)

4. Пробой мембраны лазерным микролучом

5. Обработка ультразвуком

6. Перфорация плазматической мембраны при помощи фильтров

7. Соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенной ДНК

8. Центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией

9. "Осмотическая" перфорация плазматической мембраны

Введение

 

Изучение и совершенствование одного из самых распространенных методов микроинъекции под давлением через стеклянные капилляры веществ и отдельных органелл в клетку имеет большое значение для решения различных теоретических, экспериментальных задач и многих прикладных вопросов молекулярной и клеточной биологии. Являясь элементарной операцией над клеткой, микроинъекция открывает широкие возможности исследования процессов регуляции в живой клетке. В генетике и биологии развития животных и растений методы микроинъекций применяют для изучения влияния генов на наследственность, получения клонов, исследования вопросов дифференцировки и развития клеток и тканей, проведения тонких операций на клетках. В генной и клеточной инженерии микроинъекция применяется для реконструкции клеток и при изучении экспрессии рекомбинантных молекул ДНК, открывающих широкие возможности получения трансгенных организмов с измененными генетическими признаками. В биофизике и физиологии этот метод используется для исследования транспортных процессов и влияния разнообразных биологически активных веществ на физико-химические процессы, протекающие в клетке. Микроинъецирование веществ в клетку или ткани широко используются при цитологических и морфологических исследованиях.

В настоящее время различают более четырех десятков методов введения веществ в клетку: микроинъекция через стеклянные микрокапилляры под давлением или с использованием микроэлектрофореза, микроинъекция веществ при помощи слияния клетки с мембранными конструкциями («тени» эритроцитов, мембранные везикулы, липосомы), внутри которых находится инъецируемое вещество и др. (cм. Гл.1).

Во всех случаях эти приемы не всегда просты и требуют всестороннего продумывания логики и техники эксперимента.

Так, методы слияния, практически все, дают возможность производить микроинъекцию только в цитоплазму. При этом в результате слияния в состав клетки-реципиента войдут мембраны эритроцитов или липосомные оболочки.

Перенос генов с помощью молекулярных конструкций связан с учетом дальнейшей судьбы этих конструкций в клетке.

Для прямой доставки веществ или органелл в клетку из всех методов микроинъекция под давлением через стеклянные микропипетки чаще всего используется на практике. Микроинъекция осуществляется введением через тонкие стеклянные микропипетки в различные внутриклеточные органеллы или локально в отдельные участки цитоплазмы клетки минимальных доз растворов вещества, а также отдельных органелл, взятых из других клеток, — ядер, хромосом, митохондрий и других субклеточных компонентов. Процесс введения производится под действием гидравлического или пневматического давления с использованием микроманипуляционной техники.

Метод микроинъекций под давлением является наиболее эффективным, прямым способом введения веществ или органелл в клетку. Однако этот достаточно простой способ имеет для начинающих работать с ним некоторые технические трудности в точной количественной оценке вводимых веществ, требует особой тщательности при подготовке аппаратуры и при непосредственном проведении прецизионных микроинъекций.

 

Приложение

 

Приложение 1. Форма протокола условий эксперимента

(Проведение микроинъекций веществ в клетку)

 

При ведении протокола микроинъекции вопрос «зачем» можно вынести в графу «Примечания» для каждого этапа эксперимента (см. таблицу):

 

Приложение 2. Микроинъекция в клетку

(Типичная схема проведения микроинъекции)

 

Приготовление растворов:

– растворение вещества

– фильтрование

– центрифугирование

Приготовление органелл:

– препаративное

– микрохирургическое

Изготовление микропипеток

- Заточка кончиков, если это необходимо

Установка микропипеток в держатель микроманипулятора

Заполнение микропипетки инъецирующим раствором или органеллами

Установка подпорного давления для микроинъекции

Фиксация клетки:

- Определение места (точки) введения микропипетки в клетку

- Установка кончика микропипетки относительно клетки

Калибровка доз инъекции:

– по лимбу микровинта, перемещающего шток поршня шприца

– по манометру

– по объему доз (масло-вода или вода-масло)

– по перемещению мениска раствора в кончике микропипетки

Микроинъекция

Приложение 3. Достоинства и ограничения метода микроинъекции под давлением

Достоинства метода микроинъекции под давлением:

1. Возможна относительно высокая точность микроинъекции

2. Количественная оценка инъецируемых растворов сравнительно не сложная и в большинстве случаев доступная

3. Есть возможность вводить в клетку вязкие растворы, отдельные фрагменты клетки или органеллы, различные красители и инородные частицы

4. Можно вводить растворы веществ и органеллы в определенную часть клетки (самое важное достоинство этого метода)

5. Имеется возможность вводить в клетку как большие объемы растворов, так и следовые их количества (до нескольких молекул)

6. Количество инъецируемого вещества не зависит от его электрохимических свойств

7. Засорение микропипетки часто можно ликвидировать прокачиванием раствора через кончик

8. При инъецировании под давлением нет противотока из клетки в полость микропипетки

9. При низких скоростях инъекции клетка почти не травмируется, кроме механических повреждений в месте прокола, но и это можно свести к минимуму

10. Микроинъекция под давлением отличается от микроэлектрофореза высокой оперативностью, то есть проведением многодозовых инъекций с относительно большой скоростью (частотой) (до 1000-2000 микроинъекций в час)

11. Двух- и многоканальные микропипетки дают возможность использовать несколько растворов веществ или производить различные микроманипуляционные операции

12. Всегда есть возможность остановить поток диффундирующего в клетку раствора из кончика микропипетки созданием отрицательного давления дозатора

Примечание:

· Можно инъецировать незаряженные вещества или вещества с низкой электрофоретической подвижностью (такие, как масла или некоторые красители для внутриклеточного окрашивания)

· Можно инъецировать сложные растворы (например, буферы Са.ЭГТА и соединения, недоступные в чистой форме)

· Микроинъекция удобна для введения красителей в большие области клетки, что в других случаях требует продолжительного ионофореза (например, нейроны Aplysia)

· Удобна для инъецирования веществ, быстро разрушающихся или изолируемых (ионы кальция)

· Инъекционная пипетка может быть использована для освоения основных правил работы с микроманипуляционной техникой.

 

Ограничение возможностей метода микроинъекции под давлением:

1. Большая зависимость скорости высвобождения раствора от диаметра кончика микропипетки (скорость пропорциональна третьей степени внутреннего диаметра кончика). Однако, если скорость не лимитирует, то малые размеры (диаметры) кончиков микропипеток являются достоинством этого метода

2. При одинаковом давлении из разных микропипеток (с различными диаметрами, различной конусностью, гидрофобностью или липофильностью внутренней поверхности) высвобождается различное колическтио вещества

3. При отсутствии давления в микропипетке возможна спонтанная диффузия вещества в клетку или наоборот - вход вещества из клтеки или раствора в полость микропипетки

4. Не всегда возможен контроль количества инъецируемой жидкости по лимбу дозирующего устройства или по показаниям манометра. Осоденно это касается очень мадых диаметров кончика или использования нескольких очень вязких растворов, обладающих различной вязкостью

5. Гибкие шланги и сочленения могут создавать паразитную деформацию при повышении давления в микропипетке, что приводит к ошибкам при дозировании, так как во время установления равновесия после микроинъекции давление значительно увелчивается

6. Использование микропипеток с малым диаметром кончика требует применения тщательно очищенных растворов (от кристалов, сгустков, частичек) исключает использование насыщенных растворов

7. В процессе многодозовых микроинъекций белковых растворов микропипетки с малым диаметром кончика могут постепенно “обрастать”, забиваяя его просвет, что приводит к неравномерному истечению жидкости. Для микропипеток с малым диаметром кончика необходим визуальный контроль за передвижением мениска жидкости или периодический контроль дозируемых объемов

8. При очень высокой скорости истечения жидкости из кончика микропипетки поток ее (струя, трек) может повредить клетку

9. На наружной поверхности микропипетки остаются следы вещества в начале микроинъекции, а также цитоплазма и мембраны - после микроинъекции

Рекомендуемая литература

1. Александров А. А., Метод микроэлектрофореза в физиологии, Ленинград, Наука, 1983.

 

2. Газарян К. Г., Микроинъекции генов в зиготы и эмбрионы: интеграция в геном и генетические эффекты. В сб.: Успехи современной генетики, том 13, М., Наука, 75-88, 1985.

 

3. Грессман А., Грессман М., Микроинъекция превращает культуральную клетку в исследовательскую пробирку, В сб. Методы генетики соматических клеток, под ред. Дж. Шея, М., Мир, 535-544, 1985.

 

4. Никитин В. А., Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом, Пущино, 1986. Электронная копия: http://cam.psn.ru.

 

5. Попов Ю. А., Бондарев В.А., Хохлов А.М., Никитин В.А., Земскова М.Ю., «Микроинъекторы и микроинъекция генетического материала в клетки и эмбрионы» в сб.: «Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии», с.14-21, Пущино, 1978.

 

6. Зеленин А. В., Кущ А. А., Прудовский И. А., Реконструированная клетка, М. Наука, 1982.

 

7. Рекстейнер М., Введение макромолекул в клетки с помощью «теней» эритроцитов. В сб.: Методы генетики соматических клеток, под ред. Дж. Шея, том 2, М., Мир, 445-462, 1985.

 

8. Фонбрюн П., Методы микроманипуляции, М., ИЛ, 1951.

 

9. Meech R., Microinjection. In: Techniques in Cellular Physiology, P109, p. 1-16, 1981.

Список первоисточников

Александров А. А., Метод микроэлектрофореза в физиологии, Ленинград, Наука, 1983.

 

Аленьтьев А. А., Мясников А. А., Основы технологии стекла, Из-во киевского политехн. ин-та, Киев, 1958.

 

Алимарин И. П., Петрикова М. Н., Качественный и количественный ультрамикроанализ, М., «Химия», 1974.

 

Бондарев В. А., Иванов Е. Г., Никитин В. А., Попов Ю. А., Хохлов А. М., «Способ закрепления клеток на микропипетке» а.с. № 1616680, 1987.

 

Вайсман Б. Г., Голинский Г. Ф., Техника микроинъекции клонированных фрагментов ДНК (чужеродных генов) в ядро оплодотворенной яйцеклетки мышей, в сб.: Механизмы нормального и патологического эмбриогенеза млекопитающих, (Ред. проф. А.П.Дыбан), Л., с. 108-113, 1985.

 

Газарян К. Г., Микроинъекции генов в зиготы и эмбрионы: интеграция в геном и генетические эффекты. В сб.: Успехи современной генетики, том 13, М., Наука, 75-88, (1985).

 

Гердон Дж. Регуляция функции генов в развитии животных, М., Мир, 1977.

 

Глебов О. К., Генетическая трансформация соматических клеток, Л., Наука, 1989.

 

Голлербах М. М. (Еленкин А.А., Синезеленые водоросли СССР (общая часть), Изд. АН СССР, М.-Л., 1936).

 

Грессман А., Грессман М., Микроинъекция превращает культуральную клетку в исследовательскую пробирку, В сб.: Методы генетики соматических клеток, под ред. Дж. Шея, М., Мир, 535-544, 1985.

 

Кожечкин С. Н., Микроэлектроды, В сб.: Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток, под ред. Б. Н. Вепринцева, Пущино, 62-83, 1975.

 

Zelenin A.V., Titomirov A.V., Kolesnikov V.A., Genetic transformation of mouse cultured cells with help of high-velocity mechanical DNA injection, FEBS LETTERS, v.244, № 1, p. 65-67, 1989.

 

Коренман И. М., Аналитическая химия малых концентраций, М., «Химия», 1967.

 

Крастс И. П., в сб. «Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток», «Микроинъекция», Пущино, с. 138-146, 1975.

 

Курелла Г. А., Электрохимические микрометоды, В кн.: Методы изучения мембран растительных клеток, Ленинград, ЛГУ, 78-96, 1986.

 

Ларин В. Т., Никитин В. А., Хохлов А. М., Бызов А. Л., Пигарев И. Н., «Способ изготовления микропипеток» а.с. N 966043, БИ N38, с.116, 1982.

 

Никитин В. А., Гольдман И. Л., Волынчук В. Ф., «Методические рекомендации по изготовлению и применению микроинструментов для микроманипуляции с эмбрионами млекопитающих, Из-во ВИЖ, М., 1980.

 

Никитин В. А., Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом, Пущино, 1986. Электронная копия: http://cam.psn.ru.

 

Оствальд, Лютер, Друкер К. Физико-химические измерения, ОНТИ, Химтеорет, Ленинград, т. 1-2, 1935.

 

Осборн Н. Н., Микрохимический анализ нервной ткани, М., Медицина, 1978.

 

Первис Р., Микроэлектродные методы внутриклеточной регистрации и ионофореза, М., Мир, 1983.

 

Перфильев Б. В., Габе Д. Р., Капиллярные методы изучения микроорганизмов, 1961.

 

Погорелов А. Г., Рейман С. Г., Использование магнитной муфты в системе заточки микроэлектродов. Физиол. журнал СССР, т. 67, c. 1110-1111, 1981.

 

Попов Ю. А., Бондарев В.А., Хохлов А.М., Никитин В.А., Земскова М.Ю., «Микроинъекторы и микроинъекция генетического материала в клетки и эмбрионы» в сб.: «Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии», с.14-21, 1978. Пущино.

 

Зеленин А. В., Кущ А. А., Прудовский И. А., Реконструированная клетка, М. Наука, (1982).

 

Рекстейнер М., Введение макромолекул в клетки с помощью «теней» эритроцитов. В сб.: Методы генетики соматических клеток, под ред., Дж. Шея, том 2, М., Мир, 445-462, 1985.

 

Ратнер Е. Н., Никитин В. А., Фихте Б. Ф., Физическая фрактография – новый подход к изучению прочностных свойств стенок микроорганизмов, в сб.: «Дезинтеграция микроорганизмов», Пущино-на-Оке, с. 131-141, 1972.

 

«Современные проблемы оогенеза», ответственный редактор Т.А.Детлаф, Из-во «Наука», 1977).

 

Тельг Г. Элементный ультрамикроанализ, М., «Химия», 1973.

 

Фонбрюн П., Методы микроманипуляции, М., ИЛ, 1951.

 

Фролов Ю. Г., Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы, М., «Химия», 1982.

 

Фихте Б. Ф., Никитин В. А., Ратнер Е. Н., в кн.: «Микроманипуляционные методы экспериментальной микробиологии», гл.5, «Организация микроманипуляционных исследований и некоторые приемы их практического применения», М., Из-во МГУ, стр. 140-169, 1977.

 

Штраубингер Р., Папахаджопулос Д., Перенос ДНК с помощью липосом. В сб.: Методы генетики соматических клеток, Под. ред. Дж. Шея, том 2, М., Мир, 462-480, 1985.

 

Экклс Дж., Физиология синапсов, М., Мир, 1966.

 

Юдин А. Л., Микрохирургическая трансплантация ядер и цитоплазмы у парамеций в исследованиях ядерно-цитоплазматических взаимоотношений. В сб.: Биология развития и управление наследственностью, М., Наука, 1986.

 

Яворский Б. М., Детлаф А. Л. Справочник по физике, М., Наука, 1964.

 

Bader, Ch., Bertrand, D., Bertrand, G., Perrelet, A., A pressure device for intracellulars injection. Experientia 30, p. 1366-1367, 1974.

 

Baldwin D. J., Dry bevelling of micropipette electrodes, J. Neuroscience Methods, 2, 153-161, 1980.

 

Barber M. A., Technique for inoculating bacteria and other substances into living cells. Journ. Inf. Dis., 8. p. 348-360, 1911.

 

Barber M. A., A pipette method in the isolation of single microorganisms and in the inoculation of substances into living cells. Philippine Journ. Sci., 9, p. 307-360, 1914.

 

Boyd A. L., Expression of cloned genes microinjection into cultured mouse and human cells, Gene Anal. Tech. 2(1), p. 1-9, 1985.

 

Briano R. J., A reproducible technique for breeking glass micropipettes over a wide range of tip diameters. J. Neurosci. Methods, vol. 9, 34, 1983.

 

Brown K. T., Flaming D. G., Bevelling of fine micropipette tips by a rapid precision method, Science, N. Y., 185, 693-695 (1974).

 

Chembers R., A simple apparatus for micro-manipulation under the highest magnifications of the microscope, Science, 54, 1921.

 

Chembers R., New micromanipulator and method for the isolation of a single bacterium and the manipulation of living cells. Journ. Inf. Dis., 31, 1923.

 

Capecchi M. R., Hing efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells, Cell, vol. 22, pp. 479-488, 1980.

 

Contreras R., Cheroutre H., Fiers W., A Simple Apparatus for Injection of Nanoliter Quantities into Xenopus laevis Ocutes, Analitical Biochemistry, 113, p. 185-187, 1981.

 

Curtis D. R., Microelectrophoresis. In: Physical Techniques in Biological Research, vol. 5, «Electrophysiological Methods», Part A (W. L. Nastuk, ed.), pp. 144-190, Academic Press, New York and London, 1964.

 

Dani, S.U., The challenge of vector development in gene therapy, Braz J., Med Biol Res, February, Volume 32(2) 133-145, 1999.

 

Diacumakos E. G., Garnjobst L., Tatum E. L., A cytoplasmic character in Neurospora crassa. The Role of Nuclei and Mitochondria, J. Cell Biology. v. 26, N2 p. 4427-443, 1965.

 

Di Mayora, G. A., Eddy, B. E., Stewart, S. E., et.al. Isolation of infections deoxyribonucleic acid from SE polyomainfected tissue cultures, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, v. 45, 1805-1808, 1959.

 

El-Badry H. M. Micromanipulators and micromanipulation. In: Monografien aus dem Gebiet der qualitativen Microanalse. Ed. A. A. Beneditti-Puchler. Springer, Wien, 1963.

 

Einck L., Bustin M., Inhibition of transcription in somatic cells by microinjection of antibodies of chromosomal proteins, PNAS, v. 80, N22, p.6735-39, 1983.

 

Fournier R., Ruddle F., Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human automatic cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 319-323, 1977.

 

Fraley R., Papahadjopoulos D., Liposomes: The development of a new carrier system for introducing nucleic acid into and animal cells. In: Current Topics in Microbiology and Immunology: Gene Cloning in Organizm Other Than E.coli (P. H. Hofschneider and W. Goebel, eds.), vol. 96, pp. 171-192, Springer-Verlag, Heidelberg, 1982).

 

Frank K., Becker M. C., Microelectrodes for recording and stimulation. In: Physical Techniques in Biological Research, Vol. 5, «Electrophysiological Methods», Part A (W. L. Nastuk, ed), p. 22-87, Academic Press, New York and London, 1964.

 

Furusava, M., Nishimura, T., Yamaizumi, M., Okada, Y. Injection of foreign substances into single cells by cell fusion. Nature, (London) 249, 449-450, 1974.

 

Furusava, M., Cellular microinjection by cell fusion: Technique and application in biology and medicine, Int. Rev. Cytol., 62, 29, 1980.

 

Gardner R. L., Mouse chimaeras obtained by the injection of cells into the blastocyt, Nature, v. 220, p. 596-597, 1968.

 

Graessmann A., Doctorial Dissertation, Free University of Berlin, 1968. (Цититуется по Грессман, Грессман, 1985).

 

Graessmann M., Graessmann A., Mueller C., Monkey cells transformed by SV-40 DNA fragments flat revertants synthesize large and small T-antigens, Watson J. D., Sambrook J., Botchan M., (Ed.), Cold Spring Harbor Symposia an quantitative biology, vol. 44 viral oncogenes, parts 1 and 2; Cold Spring Harbor, N. Y. USA, 1979, XV-601P (part 1), XVII+720P (part 2) Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor N. Y. USA, Illus. ISBN 0-87969-047-7 0(0) p.605-610, 1980.

 

Graham F., Van der Eb, A new technique for the assay of infectivity of numan Adenovirus 5 DNA, Virology, 52, 456-460, 1973.

 

Griesbach R. J., Advances in the microinjection of higher plantcells, Biotechniques 3(5), p. 348-350, 1985.

 

Hamer D. H., Smith K. D., Boyer S. H., Leder P., SV40 recombinants carrying rabbit B-globin gene coding sequence, Cell, 17, 725-735, 1979.

 

Hammer R. E., Pursel V. G., Rexroad C. E., Wall R. J., Bolt D. J., Ebert K. M., Palmmiter R. D., Brinster R. L., Production of transgenic rabbits, sheep and pig by microinjection, Nature, v. 315, p. 680-683, 1985.

 

Hinnen A., Hicks J., Fink G., Transformation of yeast, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933, 1978.

 

Hyland J. K., Hirschhorn R. R., Avignolo Carlo, Mercer N. E., Ohta M., Galanti N., Jonak G. J., Baserga R., Microinjected pBR322 stimulates cellular DNA synthesis in Swiss 3T3 cells, PNAS, vol. 81, N2, pp. 400-404, 1984.

 

Isenberg G., Risk and advantages of using strongly beveled microelectrodes for electrophysiological studies in cardiac Purkinjefibers, Pflugers Arch., 380, 91-98, 1979.

 

Kater S. B., Nicholson C. Davis W. J., A guide to intracellular staining techniques. In S. B. Kater C. Nicholson (Eds.), Intracellular Staining in Neurobiology, Springer-Verlag, New York, pp. 307-325, 1973.

 

Klein, T.M., Wolf, E.D., Wu, R., Stanford, J.C., High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells, Nature, 327: 70-73, 1987.

 

Kurata S-I, Tsukakoshi M., Kasuya T., Ikawa Y., The Laser Method for Efficient Introduction of Foreign DNA into Cultured Cell, Experimental Cell Research, 162, pp. 372-378, 1986.

 

Lederer W. J., Spindler A. J., Eisner D. A., Thick slurry bevelling. A new technique for bevelling extremely fine microelectrodes and micropipettes, Pfluger's Arch., 381, pp. 287-288, 1979.

 

Lieber, M. R., Hesse, J. E., Nichol, J. M., Felsenfeld, G., J. Cell Biol., 105, 1055-1066, 1987.

 

Lin T.P., Egg micromanipulation. In: Method in mammalian embryology, San-Francisco, p. 157-171, 1971.

 

Loyter, A., Zakal, N., Kulka, R. G. Ultramicroinjection of macromolecules or small particles into animal cells. A new technique based on virus-induced cell fusion. J. Cell Biol. 66, 292-304, 1975.

 

McBrige O., Athwall R., Genetic analysis by chromosome-mediated gene transfer, in vitro, 12, 777-786, 1977.

 

McCutchen J., Pagano J., Enhancement of the infectivity of Simian Virus 40 deoxyribonucleic acid with diethylaminoethyl dextran, J. Nat. Cancer Inst., 41, 315-357, 1968.

 

McCaman R. E., McKenna D. G., and Ono J. K. A pressure system for intracellular and extracellular ejections of pikoliter volumes, Brain Res., 136, 141-147, 1977.

 

Meech R., Thomas R.C., The effect of calcium injection on the intracellular sodium and pH of snail neurons, J. Physiol. 265, 867-879 1977.

 

Meech R., Microinjection, in Techniques in Cellular Physiology, P109, p. 1-16, 1981.

 

Moustafa L. A., Brinster R. L., The fate of transplanted cells in mouse blastcysts in vitro, J. exp. Zool. 181, p. 181-192, 1972.

 

Moustafa L. A., Chimaeric rabbits from embryonic cell transplantation (38371, Proc. Soc. exp. Biol. Med., 147, p. 485-488, 1974.

 

Mueller C., Graessmann A., Graessmann M., Microinjection: turning living cells into test tubes, Trends Biochem. Sci. 5, 60-62, 1980.

 

Mulligan R. C., Howard B. H., Berg P., Synthesis of rabbit B-globin in cultured mankey kidney cells following infection with a SV40 B-globin recombinant genome, Nature, 277, 108-114, 1979.

 

Nicolson, G., Poste, G., Mechanism of resistans to ricin toxin in selected mouse lymphoma lines, J. Supramol. struct., 8, 235-245, 1978.

 

Nicaise, G., Meech R. W., The effect of microinjection on the ultrastructure of on identified molluscan murone. Brain Res. 193, 549-553, 1980.

 

Ogden T. E., Citron M. C., Prierantoni R., The jet stream microbeveler: an inexpensive way to bevel glass micropipettes, Science, N. Y., 201, pp. 469-470, 1978.

 

Peterfi T., Die mikrurgische Methodik, Handb, mikrobiol, Technik, Kraus und Uhlenhut, Urban und Schwarzenberg, Berlin, 1923.

 

Ringertz N., Savage R., Cell Hybrids, Academic Press, New York, p. 1-366, 1976). (Рингерц Н., Сэвидж Р., Гибридные клетки, Из-во «Мир», М., 1979).

 

Stow N., Wilkie N., An improved technique for obtaining enhanced infectivity with Herpes Simplex Virus Type I DNA, J. Gen. Virol., 33, 447-458, 1976.

 

Schaffner W., Direct transfer of cloned genes from bacteria to mammalian cells, Proc. Natl. Sci. USA, 77, 2163-2167, 1980.

 

Spindler A. J., Miniaturized intracellular pressure injector., The Journal of Physiology, London, 296, 4P-5P, 1979

 

Steinhardt R. A., Lundin L., Mazia D., Proceed. Natl Acad. Sci USA, v.68, p. 2426 1971.

 

Taylor V.C., Improved micromanipulation apparatus. Univ. calif. Pub. Zool., 26, 1925.

 

Teccheimer, M., Boylan, J. F., Parker, S., Sisken, J. E., Patal, G. L., Zimmer, S. G., PNAS, v. 84, 8463-8467, 1987.

 

Wilson J. F., Garnjobst L., Tatum E. L., Heterokaryon incompatibility in Neurospora crassa, Microinjection studies, Am. J. Bot. 48, 299, 1961.

 

Weissmann, G., Bloomgarden, d., Kaplan, R., Cohen, C., Hoffstein, S., Collins, T., Gotlieb, A., Nagle, D. A general method for the introduction of enzymes by means of immunoglobulin-coated liposomes, into lysosomes of deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 88-92, 1975.

 

Wilson, T., Papahadjopoulos, D., Taber, R., Biological properties of poliovirus encapsulated in lipid vesicles: Antibody resistance and infectivity in virus resistant cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3471-3475, 1977.

 

Wong E. A., Capecchi M. R., Effect of cell cycle position on transformation by microinjection, Somatic cells Mol. Genet. 11(1), p. 43-52, 1985.

 

Yamamoto F., Furusava M., Furusava I., Obinata M. The Pricking method. A new efficient technique for mechanically introducing foreign DNA into the nuclei of culture cells.-Exp. Cell. Res., v. 142, p. 79-84, 1982.

 

 

Программа Практикума

МИКРОИНЪЕКЦИЯ

                         

 

           Автор Программы:

        Ст.н.сотр. В.А.Никитин

 

ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

 

"Микроинъекция представляет собой один из экспериментальных методов, который нашел широкое применение только в последние 10-20 лет, и поэтому мы пока еще не располагаем сколько-нибудь подробным анализом как преимуществ, так и недостатков этого метода. Однако несомненно, что значение микроманипуляций и особенно микроинъекций, будет все более возрастать при изучении процессов регулирования в живых клетках". (Дж. Гердон, Регуляция функции генов в развитии животных, Мир, М., 1977).

Интенсивное развитие молекулярной и клеточной инженерии, методов биофизики клетки, клеточной биотехнологии и фундаментальной клеточной биологии выдвигает весьма важную проблему о работе непосредственно с отдельной клеткой. Что может дать такой подход? Прежде всего возможность решать такие задачи, как манипуляция с внутриклеточными структурными элементами, проведение тонких операций с ними, введение в клетку чужеродных веществ, генного материала, изоляция или трансплантация органелл с целью реконструкции клетки, получение чистого клона генетически идентичных клеток или организмов, а также получение трансгенных животных или растений. Такие работы у нас в стране и за рубежом достаточно широко применяются не только в лабораториях исследовательских институтов и университетов, но в медицинской практике, сельском хозяйстве и промышленной биотехнологии. В связи с охраной животного и растительного мира, редких и исчезающих видов животных и растений в исследовательской практике нашел применение термин "клетка - как альтернативный объект исследования", или так называемые "альтернативные" методы проведения экспериментов на единичных клетках без использования лабораторных животных. Клетка растений или животных рассматривается в настоящее время как: «биореактор», «пробирка» для биохимиков, объект для скрининга лекарственных препаратов, генетический источник для клонирования организмов, полигон для трансгенных исследований, объект получения отдельных органов для трансплантации и пр. Именно поэтому внимание к клетке как объекту исследования будет возрастать. Соответственно уже сегодня необходимо закладывать и развивать основы техники и эксперимента с отдельной клеткой.

Микроинъекция нами рассматривается как достаточно сложная операция над клеткой, подготовка клетки к микроинъекции, от того, как вводится микропипетка в клетку, от того, как производится введение вещества в клетку и, наконец, как выводится микропипетка из клетки и как обеспечивается ее дальнейшее культивирование, от этих основных элементов микрохирургии клетки (или другой термин, принятый в литературе - микрургии клетки) и метода микроинъекции в клетку зависит успех эксперимента.

 Цель практикума: знакомство с классическими и новейшими методами микроинъекций веществ и органелл в клетки млекопитающих и растений, с широкими возможностями применения и/или изготовления микроинструментария, работа с биологическим материалом под микроскопом, постановка задачи эксперимента и выбор необходимой техники.

Задача практикума: овладение методами работы с микроманипуляторами, микрокузницей, работа со стеклом, самостоятельное изготовление микроинструментов, обучение отдельным приемам микрохирургии клетки и ранних эмбрионов, овладение методами микроинъекции различных веществ (красителей, генетического материала и отдельных органелл).

Практикум предназначен для студентов по специальностям: биофизика, молекулярная биология, генетика, эмбриология, биотехнология, микробиология.

 

 

ПРОГРАММА ПРАКТИКУМА

 

А. Введение. Области применения микроинъекции под давлением. (некоторые примеры применения микроинъекции в биологических науках). Задачи, решаемые при помощи метода

микроинъекции. Молекулярная биология: Введение чужеродных генов в клетку, микроинъекция как метод для исследования трансформации и экспрессии генов, изучение рекомбинантных ДНК. Генная и клеточная инженерия: Реконструкция генов, введение генов и отдельных их компонентов в клетки, исследования по генетике популяций. Молекулярная и клеточная иммунология: Введение моноклональных антител в клетку, микроинъекция как составной элемент иммунологических методов исследования (введение генов в клетки, работа с гибридомами). Биофизика: для исследования природы изменения проницаемости клеточных мембран, для изменения концентрационных градиентов ионов при изучении постсинаптических потенциалов. Микробиология: Исследование по генетике микроорганизмов, получение чистых культур, клонирование микроорганизмов. Биохимия: Микроинъекция дает возможность работать с клеткой, как с "пробиркой" для исследования различных биохимических реакций. Микрохимия: Отбор и микроманипулирование микродозами биологического материала, отделение компонентов клетки для микроанализов, испытание различных веществ, микрохимический анализ - качественный и количественный. Генетика: Перенос чужеродных генов в геном животных для исследования механизмов мутагенеза и проблем нестабильных генов. Биология развития: Пересадка ядер, хромосом и других органелл с целью реконструкции клеток, исследования ядерно-цитоплазматических взаимодействий в развитии клетки. Физиология и морфология: Применение внутриклеточных инъекций в нейрофизиологии, введение красителей, в том числе и красителей группы люцифера желтого, введение радиоактивно меченных веществ.

 

Б. Современные достижения в области введения веществ и органелл в клетку

Классификация методов микроинъекции:

 

Методы прямой микроинъекции