Влияние разных типов хронического стресса на экспрессию генов дофаминэргической системы на вивальной модели крыс

ВЛИЯНИЕ РАЗНЫХ ТИПОВ ХРОНИЧЕСКОГО СТРЕССА НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ДОФАМИНЭРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ НА ВИВАЛЬНОЙ МОДЕЛИ КРЫС

Работа завершена:

«__» ______ 2021 г. ___________________          (А. Д. Мухаметшина)

 

Работа допущена к защите:

Научный руководитель

(Доц., канд. биол. наук.)

«__»______ 2021 г. ___________________          (О. А. Кравцова)

 

 

Казань – 2021

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 3

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................. 7

1.1 Cтресс и его влияние на организм на генном уровне..................................... 7

1.4. Модель хронического стресса на крысах..................................................... 10

1.2. Дофаминергическая система регуляции....................................................... 12

1.3. Гены, кодирующие белки, вовлеченные в синтез дофамина, его инактивацию и рецепцию........................................................................................................ 15

1.4. Связь стресса с дофаминергической системой............................................. 32

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................... 34

2.1 Реактивы и оборудования.............................................................................. 34

2.2 Объекты исследования.................................................................................... 35

2. 3 Определение измененния экспрессии генов дофаминэргической системы у крыс. 38

2.4 Статистическая обработка результатов......................................................... 38

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................... 39

3.1 Описание первого подраздела....................................................................... 39

ВЫВОДЫ..................................................................................................... 39

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................... 41

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................ 49

 

 

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы активно изучаются послед-

ствия хронического социального стресса [1–3],

вызванного повторным опытом поражений в еже-

дневных конфронтациях самцов мышей. Под вли-

янием стресса у животных изменяется социальное

поведение, развивается тревожно-депрессивное

состояние, ангедония, снижается двигательная и

исследовательская активность, в регуляции кото-

рых принимают участие дофаминергические си-

стемы головного мозга. У таких животных изменя-

ется уровень дофамина и/или его основного мета-

болита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты в

различных структурах головного мозга [2, 4, 5].

Направленность и характер изменений показате-

лей метаболизма дофамина зависели от длитель-

ности негативного социального опыта (стресса) и

исследуемой структуры мозга. Вслед за метаболиз-

мом дофамина изменялись аффинность и/или чис-

ло дофаминовых рецепторов первого типа во фрон-

тальной коре, стриатуме и миндалине, а также раз-

вивалась десенситизация к фармакологической

блокаде этих рецепторов [2, 6]. В целом результаты

свидетельствовали о снижении дофаминергической

активности, вызванном длительным социальным

стрессом у самцов мышей [2]. Данные по измене-

нию экспрессии генов рецепторов дофамина типа 1

и 2 под влиянием хронического социального стресса

противоречивы [7, 8]. Ранее показали, что у подверг-

нутых стрессу животных изменяется экспрессия

многих генов в прилежащих ядрах [3], а также в яд-

рах шва среднего мозга [9, 10

В последние годы активно изучаются послед-

ствия хронического социального стресса [1–3],

вызванного повторным опытом поражений в еже-

дневных конфронтациях самцов мышей. Под вли-

янием стресса у животных изменяется социальное

поведение, развивается тревожно-депрессивное

состояние, ангедония, снижается двигательная и

исследовательская активность, в регуляции кото-

рых принимают участие дофаминергические си-

стемы головного мозга. У таких животных изменя-

ется уровень дофамина и/или его основного мета-

болита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты в

различных структурах головного мозга [2, 4, 5].

Направленность и характер изменений показате-

лей метаболизма дофамина зависели от длитель-

ности негативного социального опыта (стресса) и

исследуемой структуры мозга. Вслед за метаболиз-

мом дофамина изменялись аффинность и/или чис-

ло дофаминовых рецепторов первого типа во фрон-

тальной коре, стриатуме и миндалине, а также раз-

вивалась десенситизация к фармакологической

блокаде этих рецепторов [2, 6]. В целом результаты

свидетельствовали о снижении дофаминергической

активности, вызванном длительным социальным

стрессом у самцов мышей [2]. Данные по измене-

нию экспрессии генов рецепторов дофамина типа 1

и 2 под влиянием хронического социального стресса

противоречивы [7, 8]. Ранее показали, что у подверг-

нутых стрессу животных изменяется экспрессия

многих генов в прилежащих ядрах [3], а также в яд-

рах шва среднего мозга [9, 10

В последние годы активно изучаются послед-

ствия хронического социального стресса [1–3],

вызванного повторным опытом поражений в еже-

дневных конфронтациях самцов мышей. Под вли-

янием стресса у животных изменяется социальное

поведение, развивается тревожно-депрессивное

состояние, ангедония, снижается двигательная и

исследовательская активность, в регуляции кото-

рых принимают участие дофаминергические си-

стемы головного мозга. У таких животных изменя-

ется уровень дофамина и/или его основного мета-

болита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты в

различных структурах головного мозга [2, 4, 5].

Направленность и характер изменений показате-

лей метаболизма дофамина зависели от длитель-

ности негативного социального опыта (стресса) и

исследуемой структуры мозга. Вслед за метаболиз-

мом дофамина изменялись аффинность и/или чис-

ло дофаминовых рецепторов первого типа во фрон-

тальной коре, стриатуме и миндалине, а также раз-

вивалась десенситизация к фармакологической

блокаде этих рецепторов [2, 6]. В целом результаты

свидетельствовали о снижении дофаминергической

активности, вызванном длительным социальным

стрессом у самцов мышей [2]. Данные по измене-

нию экспрессии генов рецепторов дофамина типа 1

и 2 под влиянием хронического социального стресса

противоречивы [7, 8]. Ранее показали, что у подверг-

нутых стрессу животных изменяется экспрессия

многих генов в прилежащих ядрах [3], а также в яд-

рах шва среднего мозга [9, 10

В последние годы активно изучаются последствия хронического стресса на вивальной модели крыс. Модели на животных внесли значительный вклад в современное понимание механизмов, лежащих в основе роли стресса в здоровье и болезнях [Gavrilović et al., 2018].

 В современном мире во многих ситуациях мы подвержены стрессу (состоянию неспецифического напряжения в организме, которое проявляется реальными морфологическими изменениями в различных органах и особенно в эндокринных железах). И если острый стресс может иметь положительное воздействие на организм, то под влиянием хронического стресса, как правило, наносится вред здоровью, приводящий к серьезным заболеваниям- у животных могут изменяться социальное поведение, развивиться тревожно-депрессивное состояние, снизится двигательная и исследовательская активность, в регуляции которых принимают участие дофаминергические системы головного мозга. У таких животных изменяется уровень дофамина и/или его основного метаболита 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты в различных структурах головного мозга, что связано с изменением экспрессии генов ДА-системы [Дюжикова, Даев, 2018].

Дофаминергическая нейротрансмиссия адаптирует организм преодолевать стресс, а для активации нейротрансмиттерной функции дофамина необходимо связывание с рецепторами. Учитывая данные экспериментов на животных, свидетельствующие о том, что воздействие умеренных стрессоров усиливает дофаминергическую активность, в то время как тяжелые хронические стрессоры связаны с притупление дофаминергической системы [Schultchen et al., 2019; Stults-Kolehmainen, Sinha, 2014], остается нерешенным ключевой вопрос - каково влияние хронических неблагоприятных факторов на экспрессию генов рецепторов дофамина первого и второго типа у крыс именно в периферической крови.

 Данные по изменению экспрессии генов рецепторов дофамина типа 1 и 2 под влиянием хронического социального стресса противоречивы, однако было показано, что у подвергнутых стрессу животных изменяется экспрессия многих генов в прилежащих ядрах, а также в ядрах шва среднего мозга [Коваленко и др., 2016]. Исходя из этого особый интерес представляет исследование экспрессии генов, лежащих в основе системы регуляции дофамина, в крови как потенциального маркера оценки выраженности хронического стресса.

Так, в нашей работе внимание было обращено на гены, обеспечивающие работу дофаминергических систем (ДА-ергическая система) и кодирующие белки, вовлеченные в синтез дофамина (ДА), его инактивацию и рецепцию: Th, DDC, COMT, MAO-B, BDNF, CRH; а также Drd1, Drd2, Drd3, Drd4, Drd5.

Данное исследование направлено на выяснение долговременных изменений на уровне экспрессии мРНК ключевых белков ДА-ергической системы в экспериментальной модели двух типов хронического стресса. В нашей работе крысы испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (ИФН) (7 минут с грузом 8 % от массы тела) в лабиринте Морриса и 90-минутной иммобилизацией (ИС) в специальном фиксаторе в течение 14 дней.

Объектом дипломной работы являются 4 группы крыс линии Вистар (100 самцов и 120 самок) в возрасте 6 месяцев, подвергавшихся разным видам стрессорного воздействия на протяжении 6 месяцев. I группа (n=9) – интактные крысы; II группа (плавание, n=12) – крысы испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (7 минут с грузом 8 % от массы тела) в лабиринте Морриса. У крыс III группы хронический стресс вызывался 90-минутной иммобилизацией в специальном фиксаторе в течение 14 дней (иммобилизационный стресс, ИС, n=9). IV группа (плавание + ИС, n=10) включала комплексную комбинацию стрессовой нагрузки из II и III группы.

Предметом дипломной работы является уровень экспрессии рецепторов генов и генов, обеспечивающих работу дофаминергических систем и кодирующих белки, вовлеченные в синтез дофамина, его инактивацию и рецепцию: TH, DDC, COMT, MAO-B, BDNF, CRH; а также Drd1, Drd2, Drd3, Drd4, Drd5, определенные на 3-й и 6-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из крови хвостовой вены.

Поскольку в формирование хронического стресса вовлечена, в первую очередь, ДА-ергическая система, действие которой обусловлено эффективностью рецепторного аппарата, целью данного исследования является изучение динамики изменений экспрессии ключевых генов рецепторов ДА-ергической системы (Drd1, Drd2, Drd3, Drd5, Th, Ddc, COMT, MAO-B, BDNF, CRH) в крови крыс, подвергшихся двумя типам хронического стресса. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1) Изучить изменения экспрессии РНК ключевых белков ДА-ергической системы- Drd1, Drd2, Drd-3 Drd5, TH, DDC, COMT, MAO-B, BDNF, CRH -рецепторов под влиянием хронического стресса в ИФН в бассейне для теста Мориса у II группы крыс, относящихся к группе «плавания»

 2) Изучить изменения экспрессии РНК ключевых белков ДА-ергической системы - Drd1, Drd2, Drd-3, Drd5, TH, DDC, COMT, MAOB, BDNF, CRH-рецепторов под влиянием хронического ИС у крыс III группы.

 3) Изучить изменения экспрессии генов рецепторов ДА-ергической системы в IV группе крыс, подвершихся двум типам хронического стресса из II и III группы - «плавание» и «иммобилизация».

4) Сравнить изменения экспрессии генов трех перечисленных выше групп крыс относительно контрольной I группы.

Проведенный анализ экспрессии РНК ключевых белков ДА-ергической системы у подверженных хроническому стрессу животных позволил получить новые знания, необходимые для понимания изменени экспресси генов рецепторов ДА при продолжительном воздействии стрессовых факторов на организм. Модель хронической изоляции и длительного плавания в бассейне с грузом на крысах может быть хорошей моделью в исследовании терапевтической роли физических упражнений при заболеваниях человека, вызванных хроническим стрессом.

В работе были получены новые данные об подавлении экспрессии генов рецепторов дофаминергической системы после подверженного стресса. Дана характеристика дофамина и ДА-ергической системе, описана ее структура, определены ее роли в функционировании организма, даны рекомендации по увеличению уровня экспрессии.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ген DRD1

Ген DRD1 кодирует подтип D1 дофаминового рецептора — наиболее распространенный подтип рецепторов дофамина в центральной нервной системе. Альтернативные сайты инициации транскрипции приводят к появлению двух вариантов транскрипции этого гена.

У человека рецепторы D1, кодируемые генами DRD1, экспрессируются в префронтальной коре головного мозга и отвечают за такие процессы, как формирование рабочей памяти, обучение, развитие мелкой моторики и мотивации, а также вовлечены в развитие патологических состояний, например, при опиоидной зависимости [Nerenz, 2018].

Рецептор дофамина D1 относится к семейству сопряжённых с G-белками рецепторов. Как и все белки этого семейства, он включает семь кластеров гидрофобных аминокислотных остатков. Рецептор D1 имеет высокую степень структурной гомологии с другим рецептором дофамина — D5, они оба связывают аналогичные препараты и входят в группу D1-подобных рецепторов [Dearry et al., 1990].

Рецептор дофамина D1 стимулирует аденилатциклазу и активирует цАМФ-зависимые протеинкиназы, оказывая таким образом влияние на различные сигнальные пути. Этот рецептор регулирует рост и развитие нейронов, определяет некоторые поведенческие реакции [Кириченко Е.Н., 2020].

Природный лиганд этого класса рецепторов, дофамин, — гормон и нейромедиатор, который обеспечивает когнитивные функции, а также отвечает за чувство удовлетворения, любви и привязанности. Дофамин связан с формированием целенаправленного поведения, его также называют «молекулярный пряник». Рецептор дофамина D1 модулирует процессы, связанные с рецептором дофамина D2. Так, в случае ожидаемого поощрения активируется дофаминовый рецептор подтипа D1, а при его отсутствии — подтипа D2.

Мутации гена DRD1 ассоциированы с поведенческими расстройствами и вовлечены в возникновение патологических состояний: никотиновой, кокаиновой и алкогольной зависимости, депрессии, шизофрении и т. д. [Yang et al.,2000].

Ген DRD1 состоит из одного экзона и кодирует белок из 446 аминокислот с молекулярной массой 49 300 кДа и трансмембранной топологией. Этот белок представляет собой тканеспецифичный рецептор.

Транскрипция гена DRD1 регулируется двумя промоторами. мРНК гена DRD1 экспрессируется в центральной нервной системе. Наиболее высокие уровни экспрессии наблюдаются в дорсальном и вентральном полосатом теле (прилежащее ядро и обонятельный бугорок). Более низкие — в базолатеральной миндалине, коре головного мозга, перегородке, таламусе и гипоталамусе.

Ген DRD1 вовлечен в этиологию различных психоневрологических заболеваний [Ахмедова, 2020].

Ген DRD2

Ген DRD2 кодирует D2-рецептор дофамина — один из наиболее распространённых типов дофаминовых рецепторов в головном мозге. D2- рецепторы обеспечивают функционирование дофаминергической системы. Полиморфизмы в гене DRD2 приводят к изменению экспрессии D2-рецепторов, что является одной из причин возникновения шизофрении.  У человека рецептор D2, кодируемые генами DRD2, экспрессируются преимущественно в тканях мозга: среднем мозге, лимбической системе, коре головного мозга, а также встречаются и в сердечно-сосудистой системе, почках, сетчатке глаза, гипофизе [Серяпина, 2019] и отвечает за такие процессы, как формирование рабочей памяти, обучение, развитие мелкой моторики и мотивации, а также вовлечены в развитие патологических состояний, например, при опиоидной зависимости [Nerenz, 2018].

Ген DRD2 расположен на 11-й хромосоме (11q22-q23), состоит из 8 экзонов (1245 пар нуклеотидов). Альтернативный сплайсинг 6-го экзона приводит к образованию двух изоформ: D2S и D2L [Серяпина, 2019].

Белок D2-рецептора синтезируется в двух изоформах: D2S (415 аминокислот) и D2L (444 аминокислоты). Связываясь с дофамином, D2-рецепторы участвуют в деятельности дофаминергической системы: регуляции гемодинамики и метаболизма, реализации двигательных актов, контроле настроения, мотивации, памяти, внимания и прочее.

Нарушения в функционировании дофаминергической нейромедиаторной системы (особенно изменение плотности D2-рецепторов) признаны одной из основных причин развития шизофрении [Moriguchi et al., 2013]. Повышение экспрессии D2-рецепторов связывают с такими симптомами как бред, расстройства мышления, снижение мотивации и развитие социальной ангедонии. Также известно, что D2-рецепторы участвуют в осуществлении двигательных актов, и изменение их экспрессии является одной из причин развития болезни Паркинсона. Дофаминергическая система вовлечена в механизм подкрепления различных зависимосте. Гиперчувствительность дофаминовых рецепторов 2 типа, кодируемых геном DRD2, играет ключевую роль в возникновении дофаминергической мигрени [Серяпина, 2019].

В составе гена DRD2 описано несколько десятков полиморфных локусов, функциональное значение которых интенсивно изучается с целью обнаружения взаимосвязей как с развитием шизофрении, так и с отдельными характеристиками шизофренического процесса [Liu et al., 2014].

Ген DRD3

Ген DRD3 кодирует подтип D3 рецептора дофамина — один из пяти рецепторов дофамина человека, который по своей фармакологии и сигнальной системе отличается от рецепторов D1 и D2. Рецепторы дофамина D3 расположены как в пресинаптических мембранах нервных клеток (ауторецептор), так и в постсинаптических мембранах. Рецептор дофамина D3 локализован в лимбической системе мозга, которая связана с когнитивными, эмоциональными и эндокринными функциями[Guma et al., 2019; Nakajima et al., 2013].

Полиморфизмы гена DRD3 могут оказывать влияние на формирование ответа на антипсихотические препараты, способствуют развитию алкогольной, никотиновой и героиновой зависимости. Мутации этого гена имеют связь с такими заболеваниями, как депрессия, аутизм, шизофрения, болезнь Паркинсона, а также с поведенческими и психическими нарушениями [Кириченко., 2020].

Ген DRD3 схож с геном DRD2, но отличается от большинства других генов рецепторов дофамина. Содержит 5 интронных областей, положение двух из которых соответствует положению интронов гена DRD2. Альтернативный сплайсинг гена DRD3 приводит к образованию вариантов транскрипта, кодирующих разные изоформы белка, хотя некоторые варианты могут подвергаться нонсенс-опосредованному распаду мРНК (цитоплазматическая система контроля качества мРНК) [Кириченко., 2020].

Ген DRD3 кодирует белок из 446 аминокислот, принадлежащий к семейству рецепторов, сопряжённых с G-белками. G-белки опосредуют активность рецептора D3, который, как и рецепторы дофамина D2 и D4, ингибирует аденилатциклазу [2].

Ген дофаминового рецептора D3 причастен к развитию шизофрении, аутизма и расстройств, связанных с употреблением психоактивных веществ. Также DRD3 связан с эмоциональной реактивностью, исполнительным функционированием, реакцией на стресс и последствиями посттравматического стрессового расстройства [Кириченко., 2020].

Ген DRD5

Этот ген кодирует подтип D5 дофаминового рецептора. Подтип D5 представляет собой рецептор, связанный с G-белком, который стимулирует аденилатциклазу. Этот рецептор экспрессируется в нейронах лимбических областей мозга. Он имеет в 10 раз более высокое сродство к дофамину, чем подтип D1. Псевдогены, связанные с этим геном, находятся на хромосомах 1 и 2.

Структурно и функционально DRD5 подобен рецептору допамина D1 (DRD1). Ген кодирует белок из 475 аминокислот со структурными особенностями, которые соответствуют рецепторам, связанным с G-белком.

Ген содержит 2 экзона, разделенных небольшим интроном различного размера (179 или 155 п.н.). Сайт начала транскрипции находится на 2125 п.н. выше сайта инициации трансляции.

Полиморфизмы в гене DRD5, по-видимому, связаны с общим поведенческим состоянием, называемым синдромом дефицита внимания/гиперактивности (СДВГ). Это состояние, которое обычно начинается в детстве, характеризуется чрезмерной активностью, импульсивным поведением и трудностями в обращении внимания [Beaulieu, Gainetdinov, 2011].

Рецептор D5 экспрессируется в разных участках мозга: в пирамидальных нейронах префронтальной коры, поясной коре, энторинальной коре, чёрной субстанции, зубчатой извилине, гиппокампе и гипоталамусе и участвует в регуляции двигательных процессов, а также в развитии внимания, обучении, настроении и в других физиологических реакциях [Carr et al., 2017; Megat et al., 2018].

Ген BDNF

Ген BDNF кодирует одноименный белок, который представляет собой нейротрофический фактор головного мозга. Этот белок, обнаруженный в головном и спинном мозге, способствует выживанию нервных клеток, участвует в росте, созревании (дифференцировке) и поддержании жизнедеятельности нейронов. В головном мозге белок BDNF активен в соединениях между нервными клетками (синапсами), которые осуществляют межклеточную коммуникацию. Синапсы могут изменяться и со временем адаптироваться в ответ на события, происходящие в жизни человека, и полученную информацию. Это свойство нервной системы называется синаптической пластичностью. Она имеет большое значение для процессов обучения и запоминания. Белок BDNF участвует в регуляции синаптической пластичности, реакции на стресс и настроения.

Кроме того, ген BDNF экспрессируется в областях мозга, которые контролируют прием пищи и массу тела. Белок BDNF, вероятно, способствует управлению этими функциями. Установлено, что экспрессия этого гена снижена у пациентов с болезнями Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона [Кириченко, 2020].

 Ген BDNF содержит 11 экзонов и занимает около 70 т. п. н. Сайты начала транскрипции в этом гене идентифицированы в 9 экзонах, каждый из которых был связан с функциональным промотором.

Альтернативный сплайсинг приводит к образованию множества вариантов транскриптов. По крайней мере один из этих транскриптов кодирует протеин, который в процессе протеолитических преобразований превращается в зрелый белок. Связывание этого белка с его рецептором способствует выживанию нейронов во взрослом мозге [Кириченко, 2020].

Белок BDNF входит в семейство факторов роста нервов. Он обеспечивает долговременную нейронную и поведенческую пластичность в ответ на стресс. Вызываемая им поведенческая сенсибилизация связана с его способностью вызывать сверхэкспрессию рецептора дофамина D3 в полосатом теле головного мозга. Белок BDNF вовлечен в энергетический баланс и является анорексигенным фактором, который высоко экспрессируется в ядрах вентромедиального гипоталамуса[Кириченко, 2020].

Продукт гена BDNF может быть важной детерминантой патофизиологических состояний, таких как наркомания, шизофрения или болезнь Паркинсона, при которых наблюдается аномально высокая экспрессия рецептора дофамина D3 [Guillin et al.,].

Мутации гена BDNF ассоциированы с синдромом WAGRO (ожирения и нарушения когнитивных функций) [Xu et al., 2003].

Мутация в гене BDNF влияет на общие когнитивные способности, предрасположенность к нарушению памяти, расстройствами пищевого поведения (нервная анорексия и нервная булимия), биполярным аффективным расстройством, тревожным расстройством, болезнью Альцгеймера, Паркинсона и защитным эффектом при обсессивно-компульсивном расстройстве [Han, et al., 2008].

Полиморфизм гена совместно с другими генами и серотонином влияет на импульсивную поведенческую агрессию и когнитивную импульсивность у детей с синдромом дефицита внимания / гиперактивностью (СДВГ), а также связан с аллергической астмой и ринитом [Zintzaras et al.,2020].

Ген TH

Тирозингидроксилаза ключевой фермент синтеза дофамина. Тирозингидроксилаза или тирозин-3-монооксигеназа - это фермент, ответственный за катализ превращения аминокислоты L- тирозина в L - 3,4 -дигидроксифенилаланин (L- ДОФА). Он делает это с использованием молекулярного кислорода (O 2), а также железа (Fe 2+) и тетрагидробиоптерина в качестве кофакторов. L- ДОПА является предшественником дофамина, который, в свою очередь, является предшественником важных нейромедиаторов норадреналина (норадреналина) и адреналина (адреналина). Тирозингидроксилаза катализирует лимитирующую стадию в этом синтезе катехоламинов. У людей, тирозин гидроксилазы кодируется TH гена, и фермент присутствует в центральной нервной системе (ЦНС), периферической симпатических нейронов и мозгового вещества надпочечников. https://ru.other.wiki/wiki/Tyrosine_hydroxylase

Дефицит тирозингидроксилазы приводит к нарушению синтеза дофамина, а также адреналина и норэпинефрина. Изменения активности фермента тирозингидроксилазы могут быть связаны с такими расстройствами, как дистония Сегавы, болезнь Паркинсона и шизофрения. Тирозингидроксилаза активируется зависимым от фосфорилирования связыванием с белками 14-3-3. Поскольку белки 14-3-3 также могут быть связаны с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, они создают косвенную связь между тирозингидроксилазой и этими заболеваниями. Было показано, что активность тирозингидроксилазы в мозгу пациентов с болезнью Альцгеймера значительно снижена по сравнению со здоровыми людьми.

https://ru.other.wiki/wiki/Tyrosine_hydroxylase

 

Ген DDC

l-допа декарбоксилаза (DDC), катализирует биосинтез биоактивных аминов, таких как дофамин и серотонин, экспрессируется в нервной системе и периферических тканях, включая печень, где ее физиологическая роль остается неизвестной.

Ген DDC дает инструкции по созданию фермента ароматической l-аминокислоты декарбоксилазы (AADC), который важен для мозга и нервной системы. Этот фермент участвует в выработке дофамина и серотонина, которые являются химическими посредниками, передающими сигналы между нервными клетками (нейромедиаторами).

Дофамин вырабатывается из белкового строительного блока (аминокислоты) тирозина, а серотонин-из аминокислоты триптофана. Оба нейромедиатора вырабатываются в двухступенчатом процессе. Во-первых, другие ферменты контролируют реакции, которые превращают тирозин в L-допу, а триптофан-в 5-гидрокситриптофан. Фермент AADC затем преобразует L-дофа и 5-гидрокситриптофан в дофамин и серотонин соответственно. Для этого он удаляет молекулярную структуру, называемую карбоксильной группой, состоящую из атома углерода, двух атомов кислорода и атома водорода.

Ген DDC находится на седьмой хромосоме.Мутации в гене DDC приводят к снижению активности фермента AADC. Без достаточного количества этого фермента нервные клетки производят меньше дофамина и серотонина. Дофамин и серотонин необходимы для нормальной работы нервной системы, и изменения в уровнях этих нейротрансмиттеров способствуют задержке развития, умственной отсталости, ненормальным движениям и вегетативной дисфункции, наблюдаемой у людей с дефицитом AADC.

Исследования показали, что определенные вариации (полиморфизмы) в гене DDC связаны с повышенным риском никотиновой зависимости, шизофрении, биполярного расстройства и синдрома дефицита внимания/гиперактивности (СДВГ); ген DDC состоит из 15 экзонов, охватывающих более 85 кб, и существует в виде единственной копии в гаплоидном геноме. Границы между экзонами и интронами следовали правилу AG/GT. Размеры экзонов и интронов варьировали от 20 до 400 п. н. и от 1,0 до 17,7 кб соответственно. Нетранслируемые области, расположенные в 5-основной области мРНК, кодировались экзонами 1 и 2.

Таким образом, транскрипционная активность генов дофаминовых рецепторов и генов ДА-ергической системы может выступать в качестве маркеров при оценке степени воздействия хронического стресса.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы и оборудования

1. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) - 0,5 М;

2. Додецилсульфат натрия (SDS) – 10 %;

3. Натрий хлористый (NaCl) – 0,2 М;

4. Магний хлористый (MgCl2) – 0,2 М;

5. Сахароза – 1 М;

6. Тритон Х – 100;

7. Трис-HCl – 1 М (pН 7.6, 8.0);

8. Насыщенный фенол, pH 7.8;

9. Хлороформ/изоамиловый спирт (24:1);

10.  Этанол 96%, 70%, 10%;

11.  Протеиназа P – 10 мкг/мл;

12.  1% HNO3;

13.  0.012 М Ag NO3;

14.  0.28 М Na2CO3 + 38% формальдегид;

15.  10% CH3COOH;

16.  Дистиллированная вода;

17.  Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания);

18.  Морозильник/холодильник;

19.  Водяная баня на 95°С;

20.  Микроцентрифуга на 10000-14000 об/мин;

21.  Программируемый термоциклep (Терцик), амплификатор «My Cycler» фирмы Biorad;

22.  Пробирки типа «Eppendorf» на 1,5 и 2,0 мл;

23.  Пробирки для ПЦР на 0.6 мл;

24.  Полуавтоматические микропипетки на 2-20 мкл и 20-200 мкл;

25.  Центрифуга фирмы Biorad до 3500 об/мин;

26.  Термошейкер для планшетов PST-60HL/PST-60HL-4 (SIA «BioSan», Латвия);

27.  NanoPhotometer P360(IMPLEN, Германия;

28.  CFX 96 Real-Time System;

29.  Thermo Shaker BIOSAN TS-100;

30.  TRIzol Reagent;

31.  Изопропиловый спирт (C₃H₈O);

32.  Набор реагентов для проведения обратной транскрипции MMLV RT kit «Евроген», Россия;

33.  RNaseZap® RNase Decontamination Solution (ThermoFisher scientific, США);

34.  Вода, свободная от РНКаз;

35.  MilliQ;

36.  8-луночные стрипы для проведения ПЦР и ОТ, прозрачные

Объекты исследования.

Для моделирования воздействия различных типов хронического стресса сформировано 4 группы крыс линии Вистар (30 самцов, 10 самок) в возрасте 6 месяцев, подвергавшихся разным видам стрессорного воздействия на протяжении 6 месяцев.

Первая группа («Контроль», n=9) содержалась в обычных условиях вивария без воздействия какой- либо нагрузки. Животные второй группы («Плавание», n=12) испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (7 минут с грузом 8% от массы тела) в водном лабиринте Морриса (Open Science, Россия). У животных третьей группы («Иммобилизационный стресс», «ИС», n=9) хронический стресс вызывался ежедневной 90- минутной иммобилизацией в специальном пенале- фиксаторе (Open Science, Россия) в течение 14 дней. Четвертая группа («Плавание+ИС», n=10) включала комплексную комбинацию стрессовой нагрузки путем теста вынужденного плавания и иммобилизации.

Относительный уровень экспрессии генов определяли на 3-й и 6-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из венозной крови из хвостовой вены. Выделение РНК проводили с использованием реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) согласно инструкции фирмы-производителя; качество и количество образцов оценивали спектрофотометрически на приборе NanoDrop Lite (ThermoFisher, США). Для синтеза кДНК использовали вырожденные праймеры с использованием MMLV RT kit (Евроген, Россия). Относительный уровень экспрессии генов оценивали методом 2-ΔΔCt [Livak, Schmittgen, 2001] на основании результатов, полученных в ходе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов (Applied Biosystems, США) достоверность различий определялась с использованием непараметрического статистического критерия t-тeст, различия считались достоверными при р<0.05.

Работа выполнялась на базе ЦНИЛ КГМУ и К(П)ФУ с период с апреля 2019 года по май 2021 года. Опыты проводили на половозрелых крысах, выполнены на 88 лабораторных крысах линии Wistar массой 200–500 г, возрастом 4–6 мес. Крысы относились к линии Wistar в возрасте 3 (1-ая партия) и 6 месяцев (2 партия). Первая партия, которая поступила в сентябре 2019 года, состоит из 40 крыс из которых 30 самцы, 10 самок. Вторая партия, которая поступила в феврале 2020 года состояла из 49 крыс, из которых 26 самок, 23 —самца.

Опыты проводили на половозрелых самцах

мышей линии C57BL/6J в возрасте 2.5–3 мес. Все

процедуры осуществляли в соответствии с меж-

дународными правилами и стандартами, приме-

няемыми при работе с животными (European

Communities Council Directive (86/609/EEC)) и

одобренными Комиссией по биоэтике ИЦиГ СО

РАН (Март, 24, 2010, N 613.)

Животные содержались в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к пище и воде, температура воздуха 20 ± 2 °C). Контрольные группы состояли из животных тех же партий, содержавшихся в аналогичных условиях. Bсследования соответствуют основным требованиям биомедицинской этики (European convention for the protection of vertebrate animals…, 1986).

Крыс распределяли на экспериментальные группы по типам характера с помощью теста Порсолта, который включает в себя принудительное погружение в воду организма и наблюдение за характером действия крыс. Данный тест основан на том, что грызуны, будучи помещенными в прозрачный цилиндр, наполненный водой, из которого невозможно выбраться, будут действовать по-разному. Одни довольно быстро прекращают попытки выбраться из него и просто замирают в ожидании. Другие же наоборот, начинают активно двигаться. Первое поведение интерпретируется как пассивная стратегия борьбы со стрессом (поведенческое отчаяние). Данных крыс мы относили к группе пассивных. Второе указанное поведение относится к крысам с активной деятельностью. Необходимо отметить, что крыс, которых нельзя было отнести ни к одной из приведённых групп, так как не было точно ясно, какой у них тип характера, мы в эксперимент не брали.

Для моделирования воздействия различных типов хронического стресса сформировано 4 группы крыс. I группа (n=9) – интактные крысы; II группа (плавание, n=12) – крысы испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (7 минут с грузом 8 % от массы тела) в лабиринте Морриса. У крыс III группы хронический стресс вызывался 90-минутной иммобилизацией в специальном фиксаторе в течение 14 дней (иммобилизационный стресс, ИС, n=9). IV группа (плавание + ИС, n=10) включала комплексную комбинацию стрессовой нагрузки из II и III группы.

Стрессовый фактор был вызван гиподинамией крыс, путём закручивания подопытных в тканевый материал, с помощью чего обеспечивалась обездвиживание крыс. Осуществление стресс-теста происходило в течение двух недель подряд каждый день на протяжении двух недель перед контрольными точками.. Испытуемые находились в обездвиживании в течение 90 минут.

Физические нагрузки давались с грузом 7% от массы тела и запускались в бассейн, используемый для теста Мориса, на плавание на 6-10 минут. Время нагрузки подбиралась в зависимости от адаптивных возможностей и физического состояния подопытного организма.

Фаза стресса, связанная с умеренными физическими нагрузками на первом этапе, включала в себя помещение крыс в бассейн на 6 минут. Размеры бассейна: от 1 до 2 м. Температура воды – 20-24 градуса, после плавания использовали батарею для обогрева животных.

Относительный уровень экспрессии генов определяли на 3-й и 6-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из крови хвостовой вены. Забор крови для определения теломеразной активности и уровня гормонов осуществлялся в вивариуме КГМУ (г. Казань). Забор крови проводили из латеральной хвостовой вены или вентральной/дорсальной артерии. Перед взятием крови опускали хвост крыс в тёплую воду для улучшения кровообращения и быстрому выделения образцов крови.

После взятия крови получали фракцию лейкоцитов путем центрифугирования в градиенте фиколла, подсчёт лейкоцитов осуществлялся с помощью ручного метода в счетной камере Горяева.

Описание первого подраздела

Текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст.

Текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст.

 

Текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текст текс